Лабораторные методы исследования. Бактериурия

31 Января в 20:45 12609 0


Установлено, что микробы не проникают из крови в мочу через неповрежденные почки [Рябинский B.C., Родоман В.Е., 1969, и др.]. Под бактериурией понимают наличие бактерий в свежевыпущенной моче вследствие инфекционно-воспалительного процесса в органах мочевой системы иди половых органах мужчины.

Однако наличие микробов в моче не позволяет говорить о бактериурии, так как примерно у 10 % здоровых мужчин и женщин в переднем отделе мочеиспускательного канала вегетирует микрофлора. Поэтому бактериурию, обусловленную воспалительным процессом в мочевых путях, необходимо отличать от загрязнения мочи микрофлорой мочеиспускательного канала.

Идеальным методом выявления бактериурии является получение мочи для исследования путем надлобковой капиллярной пункции мочевого пузыря.

Определение степени бактериурии

В практической работе для выявления бактериурии применяют методы определения количества микробов в 1 мл мочи, учитывая, что при гнойно-воспалительном процессе в почках или мочевых путях содержится 100 тыс. и больше микробов в 1 мл мочи, а при загрязнении ее микрофлорой мочеиспускательного канала — значительно меньше. Так, содержание 103—104 бактерий в 1 мл мочи чаще всего не имеет диагностического значения.

У детей раннего возраста и новорожденных о бактериурии следует говорить при содержании 102—103 микробных тел в 1 мл мочи [Михайлова З.М., 1982]. Определить степень бактериурии можно путем посева мочи, микроскопии осадка и с помощью химических реактивов.

Метод Гоулда

Наиболее простым и достаточно точным оказался упрощенный метод посева мочи на агар в определенных секторах чашки Петри по Gould (1965). Методика заключается в следующем: стерильной платиновой петлей диаметром 2 мм берут мочу больного после тщательного смешивания ее и помещают в сектор А чашки Петри, где осторожно распределяют, сделав 40 движений петлей по поверхности агара. Петлю стерилизуют обжиганием и проводят ею 4 раза по поверхности агара через сектор А в сектор 1.

Петлю вновь обжигают и проводят 4 полосы через 1-й сектор во 2-й, затем аналогичным образом стерильной петлей из 2-го сектора в 3-й чашки Петри помещают в термостат при температуре 37 °С на 18—24 ч, после чего оценивают результаты по числу колоний бактерий в различных секторах чашки Петри. Преимущества данного посева мочи перед обычным — его экономичность, возможность определения степени бактериурии и одновременного получения роста изолированных колоний, необходимых для дальнейшего бактериологического исследования.

Гутман и Нейлор [Guttman, Naylor, 1966] предложили определять степень бактериурии путем погружения в мочу больного стеклянной пластинки, напоминающей предметное стекло, покрытой с обеих сторон агаром и последующей инкубации ее в термостате в течение 18—24 ч при температуре 37 0С.

Фармацевтическая фирма «Орион» (Финляндия) усовершенствовала данный метод исследования, после чего он нашел широкое применение в клинической практике под названием «Урикульт». Специальную пластинку, с обеих сторон покрытую питательной средой, после погружения в мочу помещают в герметичный пластмассовый контейнер и инкубируют 18—24 ч. Степень бактериурии определяют путем сравнивания количества выросших колоний микробов с данными специальной шкалы.

У ряда больных с лейкоцитурией при посеве мочи на обычную питательную среду рост колоний микробов отсутствует. В этом случае говорят о так называемой асептической пиурии. Это может быть обусловлено несколькими причинами: 1) наличием L-форм бактерий и протопластов; 2) отсутствием роста микробов вследствие проводимой интенсивной антибактериальной терапии; 3) наличием воспалительного процесса, вызванного специфической микрофлорой, главным образом туберкулезными микобактериями, хламидиями, вирусной инфекцией или грибами типа Candida. Это требует проведения специальных исследований мочи с целью выявления возбудителей болезни.

Число бактерий в различных секторах чашки Петри в зависимости от степени бактериурии [Рябинский B.C., 1965]

yrol_12.jpg

L-формы бактерий и протоплазмы образуются под воздействием антибиотиков, антител, комплемента лизоцима. Они не имеют плотной клеточной стенки и могут сохранять жизнедеятельность только в среде с повышенным осмотическим давлением. Для выявления этих форм бактерий посев мочи осуществляют на питательную среду (агар) с добавлением сукрозы.

Микроскопия осадка мочи

В нецентрифугированной моче степень бактериурии путем микроскопии можно установить только при содержании 10 млн или больше микробов в 1 мл мочи. Поэтому для установления меньшей степени бактериурии необходимо исследование осадка центрифугированной мочи: 10 мл ее помещают в стерильную коническую пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 2500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают и оставляют 0,5 мл осадка вместе с мочой. Микропипеткой переносят 0,01 мл осадка мочи на предметное стекло и накрывают покровным размером 18 х 18 мм.

Как предметные, так и покровные стекла содержат в смеси спирта с эфиром, откуда вынимают непосредственно перед использованием. Препараты исследуют под микроскопом, лучше с помощью светлопольного фазово-контрастного устройства (ФК-4) или темнопольного фазово-контрастного устройства (МФА-2) при увеличении в 800 раз (объектив 40, окуляр 20). Содержание бактерий в 1 мл мочи можно определить по таблице, разработанной В.С.Рябинским и В.Е.Родоманом (1965).

Результаты определения степени бактериурии путем микроскопии осадка мочи показали, что стойкие достоверные результаты, сходные с результатами посева мочи, можно получить лишь при содержании 104 и больше микробов в 1 мл мочи. Имеются затруднения в подсчете количества микробов при выраженной лейкоцитурии в связи с содержанием в моче большого количества ядер и гранул разрушенных лейкоцитов, а также определения кокковой флоры, прежде всего стафилококков, которые легко принять за частицы осадка мочи. В этих случаях проводят прижизненную окраску микробов по методу М. Н. Лебедевой (1963).

На чистое предметное стекло наливают водный раствор метиленовой сини и дают ему высохнуть. Затем стекло протирают чистой сухой марлевой салфеткой до тех пор, пока налет краски на нем не примет светло-голубого оттенка. На данное стекло наносят каплю осадка мочи и накрывают покровным стеклом. При этом бактерии принимают голубую окраску; их легче увидеть и определить их форму. При фазово-контрастной микроскопии микробы, окрашенные метиленовой синью, имеют ярко-малиновую окраску в центре с ровным четким ободком темно-синего цвета по окружности, что позволяет отличить их от других патологических примесей.

Нитритный тест

Нитритный тест был разработан Гриссом [Griss, 1879] для определения загрязненности воды. Тест Грисса для диагностики инфекции мочевых путей впервые применил Weltmann в 1926 г. Принцип, на котором основано применение реактива Грисса для выявления бактериурии, заключается в следующем. В норме с мочой выделяется минимальное количество нитритов, которые нельзя определить количественными пробами. При бактериурии под воздействием бактерий происходит восстановление нитратов мочи в нитриты, которые определяются с помощью реактива Грисса.

Реактив Грисса в модификации Илосвая состоит из двух растворов: А - 0,5 г сульфаниловой кислоты, растворенной в 150 мл 30 % уксусной кислоты; Б — 0,1 г альфа-нафтиламина, растворенного в 20 мл теплой дистиллированной воды. Раствор доводят до кипения и фильтруют. Фильтрат дополняют до 150 мл 30 % уксусной кислотой. Затем оба раствора (А и Б) смешивают друг с другом и сохраняют в темной посуде, поскольку реактив нестоек. Пробу на нитриты проводят следующим образом. Берут 3 мл реактива Грисса-Илосвая и прибавляют к нему стерильной пипеткой 1 мл мочи больного.

При положительной пробе сразу же появляется стойкое ярко-красное окрашивание. Нитритный тест не бывает положительным при отсутствии микробов в моче и сравнительно редко становится положительным при содержании меньше 104 микробов в 1 мл мочи. Таким образом, нитритный тест позволяет легко и быстро выявлять высокую степень бактериурии, наблюдающуюся при инфекции мочевых путей.

ТТХ-тест

Трифенилтетразолий-хлорид (ТТХ) представляет собой органическое вещество, являющееся окислительно-восстановительным индикатором, которое под действием дегидрогеназ, образующихся в процессе жизнедеятельности бактерий, восстанавливается в течение 4—10 ч из бесцветного растворимого в воде вещества в красный трифенилформазан, не растворяющийся в воде. Впервые ТТХ-тест для определения степени бактериурии применили Simmons и Williams в 1962 г. Предложенная ими методика заключается в следующем.

Растворяют 750 мг ТТХ в 100 мл насыщенного раствора двузамещенного фосфата натрия (Na2HPО4) — основной раствор. Берут 4 мл основного раствора ТТХ и добавляют насыщенный раствор Na2HPО4 до 100 мл. Оба раствора стерилизуют фильтрацией через фильтр Зейца и хранят в темноте и холоде, поскольку ТТХ чувствителен к действию света и тепла. Основной раствор стабилен в течение 2 мес; рабочий — 2 нед. Каждые 2 нед. приготавливают свежий рабочий раствор ТТХ. Степень бактериурии с ТТХ определяют следующим образом. К 2 мл мочи в стерильной пробирке добавляют 0,5 мл рабочего раствора ТТХ, хорошо смешивают и инкубируют в термостате в течение 4—6 ч при температуре 37 0С.

При значительной бактериурии моча окрашивается в красный цвет. Следует помнить, что при содержании менее 104 и особенно 103 бактерий в 1 мл мочи образование трифенилформазана и окрашивание мочи в красный цвет бывает весьма незначительным или отсутствует. Поэтому данный тест должен применяться главным образом для выявления значительной бактериурии.

Тест Брауде

Впервые определение каталазы в моче с целью выявления бактериурии использовал Braude (1959). Около 5 мл мочи смешивают с равным объемом свежеприготовленной 3 % перекиси водорода в стерильной пробирке и оставляют в штативе при комнатной температуре на 15 мин. Если в моче есть микробы, то под воздействием выделяемой ими каталазы перекись водорода разлагается с выделением кислорода. При положительном тесте появляются пузырьки газа и на поверхности мочи образуется слой пены, количество которой позволяет ориентировочно судить о степени бактериурии.

Тест, как правило, положительный лишь при содержании 100 тыс. и больше микробов в 1 мл мочи. При наличии гематурии проводить данный тест не следует, поскольку он будет положителен за счет содержания в моче эритроцитов. Таким образом, упрощенные и ускоренные методы позволяют с уверенностью высказаться о высокой степени бактериурии (100 тыс. и больше микробов в 1 мл мочи) и, следовательно, о гнойно-воспалительном процессе в почках или мочевых путях.

Содержание бактерий в 1 мл мочи, по данным микроскопии осадка центрифугированной мочи [В.С.Рябинский, В.Е.Родоман, 1965]



yrol_13.jpg

Однако высокая степень бактериурии наблюдается далеко не во всех стадиях острого и тем более хронического пиелонефрита (в среднем у 60—70 % больных). В отдельных случаях у больного хроническим пиелонефритом может быть всего несколько тысяч микробов в 1 мл мочи. В этих случаях выявить бактериурию можно путем определения содержания бактерий в начальной и средней порциях мочи [Рябинский B.C., 1969]. Наиболее удобен для этой цели упрощенный метод посева мочи по методу Гоулда.

В случае загрязнения мочи микрофлорой мочеиспускательного канала рост колоний бактерий будет лишь в первой чашке Петри или количество колоний во 2-й чашке Петри будет значительно меньше. В противоположность этому при воспалительном процессе в мочевом пузыре и вышележащих отделах мочевого тракта количество микроорганизмов будет приблизительно одинаковым как и начальной, так и средней порциях мочи. Кроме этого, данная методика позволяет определить возбудителя пиелонефрита при смешанной флоре мочи.

Автоматизированные методы выявления бактериурии

В последние годы усилия исследователей направлены на разработку и внедрение автоматизированных методов исследования, дающих возможность проводить массовое обследование с целью выявления скрытых заболеваний при диспансеризации населения.

Данные методы выявления бактериурии основаны на определении самих бактерий или их метаболитов, продуктов жизнедеятельности в питательных средах. По принципу выявления и методу регистрации их можно разделить на фото- и кондуктометрические, электрохимические, колориметрические, газово-хроматографические, биолюминесцентные, радиометрические и др.

Основным недостатком ускоренных методов определения бактериурии является тот факт, что достоверные результаты получаются только при высоких титрах бактериурии (больше 104), поэтому они показаны лишь для всеобщей диспансеризации населения.

Определение источника бактериурии

В последние годы с целью определения источника бактериурии при меняется метод исследования бактерий мочи, покрытых антителами, внедренный Thomas и соавт. (1974). Метод основан на том, что при почечной инфекции бактерии, находясь в контакте с иммунологически активными тканями, покрываются антителами, чего не наблюдается при локализации инфекции в мочевом пузыре.

Покрытые антителами бактерии обнаруживаются в моче иммунофлюоресцентным методом. Бактерии — носители антител хорошо выявляются при флюоресцентной микроскопии осадка мочи. После добавления к нему антисыворотки к человеческому у-глобулину, меченной изотиоцинатом флюоресцеина, появляется отчетливая флюоресценция, окаймляющая бактериальные клетки.

Определение чувствительности микрофлоры мочи к антибактериальным препаратам

Применяемые в настоящее время методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (метод диффузии в агар с использованием стандартных бумажных дисков, пропитанных антибиотиками, таблеток, цилиндриков, канавок, агаровых лунок) имеют ряд существенных недостатков. Во-первых, окончательные результаты могут быть получены лишь через 2—4 сут после начала исследования. Во-вторых, невозможно выявить «зависимые» формы микробов (размножающихся только или лучше при наличии того или иного антибактериального препарата).

Эти методы сложны, трудоемки и неэкономичны. В связи с этим разработаны и внедрены в клиническую практику упрощенные ускоренные методы опредения чувствительности микрофлоры мочи к антибактериальным препаратам. В.С.Рябинский (1967) использовал для этих целей ТТХ-тест. Он основан на восстановления бесцветного растворимого в воде ТТХ в красный трифенилформазан под воздействием дегидрогеназ, образующихся в процессе роста и размножения бактерий.

Если микроорганизмы, содержащиеся в моче больного, чувствительны к испытуемому антибиотику или антибактериальному препарату, то обмен веществ и рост бактерий задерживаются и восстановления ТТХ в трифенилформазан не происходит. В зависимости от чувствительности микробов к антибактериальному препарату наблюдается различная степень угнетения жизнедеятельности микробов и, следовательно, интенсивность образования трифенилформазана и окрашивания мочи в красный цвет. Методика может быть применена даже к тем антибактериальным препаратам, к которым нет стандартных бумажных дисков.

Мочу собирают из средней порции при самостоятельном мочеиспускании или катетеризации мочевого пузыря, В стерильные пробирки наливают по 2 мл мочи и добавляют по 0,5 мл рабочего раствора ТТХ. Затем в каждую из пробирок, кроме первой (контроль), добавляют то или иное антибактериальное вещество в количестве, нужном для создания определенной концентрации в моче. Пробирки встряхивают для смешивания содержимого и помещают в термостат на 6—9 ч при температуре 37 °С, а затем оценивают полученные результаты.

Полное отсутствие покраснения мочи говорит о высокой чувствительности, менее интенсивное покраснение, по сравнению с контрольной пробиркой, — о слабой чувствительности, а более интенсивное — о благоприятных условиях для развития микробов в присутствии данного антибактериального препарата. В.Е.Родоман (1976) разработал методику полуавтоматического определения чувствительности микрофлоры мочи к антибактериальным препаратам. Сущность ее заключается в следующем.

В расплавленный агар перед разливанием его в чашки Петри добавляют определенный антибиотик или антибактериальный препарат в дозе 5—20 ЕД или 10—30 мкг в 1 мл среды. Для ускоренного определения чувствительности микрофлоры мочи в питательную среду вносят еще раствор ТТХ из расчета 2 мл рабочего раствора на 10 мл питательной среды. Мочу от 7 больных заливают в отдельные лунки специальной металлической чашки Петри. Затем с помощью полосок фильтровальной бумаги (1,2x0,9 см), закрепленных в специальном штампе, одновременно мочу всех 7 больных переносят на поверхность агара в определенные сектора чашки Петри.

Чашку Петри помешают в термостат на 18 ч при температуре 37 0С. При добавлении в агар раствора ТТХ результат исследования можно оценивать через 9 ч по окраске среды в местах будущего роста колоний микробов. Отсутствие роста микробов в секторах с добавлением определенного антибиотика или антибактериального препарата при наличии роста микроба в контрольной чашке Петри свидетельствует о высокой степени чувствительности флоры мочи к данному препарату.

Ю.М.Фельдман и М.С.Мельник (1981) предложили простой и эффективный способ определения чувствительности микрофлоры мочи к антибиотикам, основанный на способности патогенных и условно-патогенных бактерий разлагать глюкозу, изменяя при этом рН среды. Для приготовления питательной среды к 100 мл дистиллированной воды добавляют 4 г агара Эндо и кипятят 3—5 мин. В горячую среду вносят глюкозу (1 г на 100 мл). Среду разливают в чашки Петри, которые могут храниться в холодильнике 5—7 дней.

Исследуемую мочу центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин и оставляют в пробирке 1 мл мочи вместе с осадком. Осадок смешивают с оставшейся мочой и равномерно распределяют его по поверхности чашки. После контакта в течение 5-10 мин мочу сливают, чашку подсушивают 20-30 мин и на поверхность среды накладывают диски с соответствующими антибиотиками или антибактериальными веществами. Результаты оценивают через 3 1/2—5 ч.

При размножении микробов среда приобретает красный цвет. Если микрофлора мочи чувствительна к определенному антибиотику, то вокруг диска четко видна прозрачная, не изменившая цвета зона задержки роста микробов. По ее диаметру определяют чувствительность возбудителя к данному препарату: диаметр до 10 мм — микрофлора нечувствительна; 11-15 мм — слабочувствительна; 16 - 25 мм — чувствительна; более 25 мм — высокочувствительна.

К недостаткам метода следует отнести невозможность определения чувствительности к антибактериальным препаратам при содержании меньше 50 тыс. микробных тел в 1 мл мочи, а также отсутствие стандартных дисков с некоторыми антибактериальными препаратами.

Основной недостаток ускоренных методов определения антибиотикочувствительности микроорганизмов — это работа не с чистыми культурами микроорганизмов, а с нативным материалом, который используется только у тяжелых больных до получения результатов посева чистой культуры.

Обнаружение возбудителей специфической инфекции

Туберкулезные микобактерии

В настоящее время считается доказанным, что микобактерии туберкулеза, как и другие микроорганизмы, не проникают в мочу через неповрежденные почки. Поэтому важное значение в диагностике туберкулеза почек приобретает выявление микобактерий туберкулеза в моче путем микроскопии осадка мочи, окрашенного по Цилю—Нильсену (бактериоскопический метод) и посева мочи на специальную питательную среду Прейс—Школьниковой (бактериологический метод).

При исследовании мочи на туберкулезные микобактерии следует считаться с тем, что их с мочой выделяется относительно мало и небольшое количество обычно содержится в утренней моче. Поэтому для исследования собирают утреннюю порцию или мочу, выделенную больным за сутки. При отрицательном результате бактериоскопии обычного мазка исследуют мочу методом флотации.

Хламидин

Нередко вызывают воспалительные заболевания слизистых оболочек мочеполовых органов. Хламидийная инфекция распространяется половым, бытовым путем, а также путем инфицирования детей при родах, во время прохождения плода по инфицированным родовым путям.

Один из методов выделения хламидий основан на использовании желточных мешков куриных эмбрионов, другой — на выделении хламидий в культуре клеток. С.И.Соловьева и И.И.Ильин (1985) использовали три метода лабораторной диагностики хламидиозов: выявление морфологических структур микроорганизмов в соскобах из уретры при окраске по Романовскому-Гимзе, определение антигенов хламидий в соскобах из уретры при окраске методом флюоресцирующих антител в прямой модификации (МПФА) по общепринятой методике и выделение микроорганизмов в культуре клеток 929. По их мнению, для более надежного и достоверного анализа клинического материала необходимо комплексное применение обоих методов: выделение в культуре клеток и индикации хламидий при окраске соскобов методом МПФА.

В последние годы широкое распространение получил метод ДНК-диагностики возбудителей специфической инфекции, основанный на применении полимеразной цепной реакции.

Н.А. Лопаткин
Похожие статьи
показать еще
 
Урология