Молекулярно-биологические методы диагностики

24 Апреля в 23:24 4275 0


Эти методы направлены на обнаружение частиц ДНК возбудителя, в частности ВПЧ или других маркеров, в материале, полученном из патологического образования (мазке или биоптате) с помощью высокотехнологичных молекулярно-биологических методов. Они постепенно занимают заслуженное место в диагностике шейки матки (ШМ).

ВПЧ-тесты

Методы обнаружения ВПЧ (ВПЧ-тесты) основаны на способности Днк к гибридизации. Денатурированная нагреванием ДНК вируса становится одноцепочечной, и при добавлении специально приготовленной ДНК и РНК они способны комплементарно связываться и достраиваться в соответствии с нуклеотидной последовательностью, что уже более легко определяется разными методами.

Чувствительность ВПЧ-тестирования (88—100%) значительно превышает чувствительность цитологического исследования (68—86%), при этом специфичность ВПЧ-тестирования (68—97%) лишь немного уступает специфичности цитологического метода (78—99%).

Чувствительность и прогностическая значимость отрицательного теста на ВПЧ в сочетании с отрицательным результатом цитологического теста приближаются к 100%.

Указанные методы можно подразделить на 3 группы:

1. Неамплификационные, которые фиксируют наличие ДНК или РНК непосредственно в препарате или на фильтре. К ним относятся Дот-блот, Саузерн-блот, Нозерн-блот, in situ гибридизация в ткани.
2. Амплификационные, где с помощью ферментов ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы получают большое количество одинаковых фрагментов ДНК, которые идентифицируют методом гель-электрофореза. Полимеразная и лигазная цепные реакции — очень чувствительные методы, они позволяют обнаруживать различные типы ВПЧ, однако чаще всего используются в качественном исполнении, не позволяя выявить критические концентрации вируса в ткани.
3. Амплификации сигнала, где предусматривается амплификация не участка ДНК, а хемолюминесцентного сигнала от молекулы зонда, связавшегося с фрагментом генома вируса.

К последним относится система гибридизации в растворе Hybride Capture System (hc2). Наиболее распространена система, выявляющая 13 высокоонкогенных типов вируса.

В настоящее время для выявления ВПЧ активно используется Dige-пе-тест, который имеет несомненные преимущества для практики. Этот метод позволяет не только выявить ВПЧ и провести его типирование, но и определить в ткани его клинически значимую концентрацию, которая может служить прогностическим знаком, и определить тактику врача в каждой конкретной ситуации. Именно этот метод одобрен FDA для скрининга в США. Для проведения Digene-тсста можно использовать следующие образцы: клеточный материал, собранный с помощью щеточки-эндобраша, или стекло с нанесенным материалом для цитологического исследования; образец биопсийного материала.

ПЦР-тесты

Очень чувствительным и распространенным в нашей стране методом является ПЦР в качественном исполнении с типоспецифическими и видоспецифическими праймерами, позволяющая выявлять вирусные последовательности в геноме клеток опухолей ШМ в 95—100% случаев. Спектр выявляемых генотипов ВПЧ, аналитическая чувствительность и специфичность отечественных ПЦР-тестов сильно варьируют в зависимости от способов забора и обработки клинического образца, дизайна праймеров и качества реагентов, а также способа определения продуктов ПЦР.

ПЦР в реальном времени

Внедряются в практику методы ПЦР в реальном времени, которые позволяют не только определить типы ВПЧ, но и оценить клинически значимую концентрацию ДНК ВПЧ. Несмотря на широкое применение отечественных ПЦР-тестов, нельзя признать, что все они достаточно стандартизованы и прошли должную клиническую оценку.


Молекулярные маркеры пролиферации и озлокачествления

Процесс канцерогенеза характеризуется нарастанием молекулярно- генетических повреждений эпителия ШМ. Некоторые продукты этих повреждений могут стать прогностическими и диагностическими маркерами опухолевой прогрессии и в будущем послужить основой для создания тестовой скрининговой системы или стать объектом таргетной терапии.

Протеин р16INK4а

В последние годы наибольшее внимание привлекают маркеры p16INK4а и Е6/Е7 тРНК, которые можно привести в качестве примера.

Имеются данные о связи CIN и экспрессии протеина p16TMK4а, который представляет собой маркер цервикального дискариоза, или показатель изменения состояния клетки-хозяина. Считается, что сверхэкспрессия p16INK4а происходит вследствие инактивации гена ретинобластомы онкогенным белком вируса Е7. P16INK4а предотвращает фосфорилирование pRb (белка ретинулобластомы) и является опухолевым супрессором. Высокий уровень p16INK4а определяется при РШМ, при этом он повышается только в пораженных клетках; в интактных клетках РШМ p16INK4а не диагностируется.

М-РНК (mRNA) генов Е7

Установлено, что два ранних гена Е6 и Е7 гена ВПЧ являются онкогенами. Они изменяют клеточный цикл, поскольку Е6 связывается с опухолевым супрессорным белком р53, а Е7 с другим супрессорным белком - pRt> (белок ретинобластомы). Прочность образованной связи,ми степень инактивации указанных супрессорных белков определяет выраженность дальнейшей трансформации клетки.

Экспрессия специфических вирусных протеинов Е6 и Е7 требуется для поддержки злокачественного роста цервикальных клеток. Другими словами, прогрессия из ПВИ в предрак и РШМ происходит только при постоянной экспрессии Е6 и Е7.

Предложено использование полноразмерной m-RNA генов Е6 иЕ7 в качестве маркера; за рубежом имеются коммерческие тесты. Определение онкобелка Е7 в первикальном материале выявляет стадию репродуктивной инфекции, когда вирусная ДНК ВПЧ находится не в свободном (эписомальном) состоянии, а в стадии интегративной инфекции, когда ДНК вируса встраивается в геном инфицированных клеток.

Повышенный синтез онкобелка Е7 указывает на интегративную фазу инфекционного процесса, при которой очень мала вероятность спонтанной ремиссии. Уровень Е7 достоверно коррелирует с агрессивностью зарождающегося опухолевого процесса и может рассматриваться как неблагоприятный прогностический признак.

Проведен ряд исследований по изучению прогностической эффективности присутствия mRNA Е6 и Е7 в тканях РШМ (PreTect HPV-Proofer ) по сравнению с рутинным определением ДНК ВПЧ.

Важно отметить, что около 10% цервикальных раков были позитивны при использовании PreTect HPV-Proofer при негативном обычном ВПЧ ДНК-тесте, что указывает на более высокую чувствительность мРНК теста. В некоторых странах он широко используется и даже рекомендован для скрининга.

С.И. Роговская
Похожие статьи
показать еще
 
Акушерство и гинекология