Генная терапия при черепно-мозговой травме. Современные векторные системы

20 Апреля в 12:47 849 0


Учитывая, что использование генной терапии в лечении патологии ЦНС встречает ряд препят­ствий, таких как постмитотическое состояние не­рвных клеток и изоляция их гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ), важным вопросом яв­ляется создание оптимальных векторов и методов доставки их в головной мозг. Специалистами в области генной терапии определены свойства так называемого «идеального вектора», который дол­жен внедряться в широкий спектр клеток орга­низма-реципиента, эффективно доставлять тера­певтический ген, обеспечивать стабильную эксп­рессию гена после трансфекции, вызывать незна­чительный иммунный ответ, обладать тканевой специфичностью и быть способным к получению в больших количествах.

На основании данных, приведенных в несколь­ких литературных обзорах, можно дать следующие характеристики векторов, используемых в настоящее время в генной терапии при экспери­ментальной ЧМТ.

Аденовирусный вектор имеет следую­щие преимущества:

1) внедряется в постмитотические клетки;

2) трансфекция широкого спектра кле­ток и тканей;

3) аденовирусы легко выращиваются в больших количествах;

4) может переносить боль­шие отрезки ДНК.

Недостатками его являются ток­сичность, непродолжительный эффект и способ­ность вызывать иммунный ответ с выработкой ан­тител, что ограничивает его повторное назначение.

Для трансфекции трансплантируемых в ЦНС клеток, в частности фибробластов, использовал­ся ретровирусньш вектор, который интегрируется в геном и поэтому обеспечивает стабильную экс­прессию трансгенов. Недостатками его являются: 1) способность инфицировать только делящиеся клетки, в связи с чем ограничена трансфекция ней­ронов; 2) риск туморогенеза; 3) быстрая инакти­вация ретровирусов комплементом.

В связи с многочисленными несоответствиями природных вирусов качествам «идеального векто­ра» изучается возможность использования для ле­чения заболеваний ЦНС новейших смешанных ви­русных рекомбинант, в которых свойства одной вирусной системы сочетаются со свойствами дру­гой с целью улучшения трансфера и экспрессии терапевтических генов.

Среди невирусных векторов в лечении патоло­гии ЦНС наиболее изученным является примене­ние катионных липосом. Метод прост, безопасен, не сопряжен с токсичностью, легко вос­производим и почти не имеет ограничений в отно­шении размеров переносимой ДНК и типа клеток-мишеней. Липосомы готовятся следующим образом. Молекулы катионных (положительно заряженных) липидов смешиваются с молекулами ДНК, имею­щей отрицательный заряд, частично нейтрализуют его, в результате чего образуются положительно за­ряженные комплексы, в которых молекула ДНК находится в центре, а липидньге молекулы — по периферии.

Эти положительно заряженные комплек­сы могут связываться с отрицательно заряженной клеточной мембраной, и в результате такого взаи­модействия функционально активные гены эффек­тивно доставляются в клеточную цитоплазму. Недо­статками метода являются низкая эффективность трансфекции in vivo с помощью липосом, которые готовятся с использованием доступных в настоящее время катионных липидов, и неполное понимание механизмов переноса ДНК в клетку.

В то время, как трансфекция клеток-мишеней на молекулярном уровне изучена достаточно ак­тивно, проблема доставки вектора в нервную ткань (vector delivery strategies) часто остается недооце­ниваемым препятствием.

Трансваскулярная достав­ка вирусных векторов ограничена наличием ГЭБ и быстрой инактивацией вирусов в кровеносном русле комплементом. Указывается, что повышение проницаемости ГЭБ при ЧМТ может обеспечивать уникальную возможность для применения генной терапии как с использованием вирусных векторов, так и липосом, проникновение которых в непов­режденный мозг ограничено, несмотря на отмеченную способность пересекать ГЭБ.


Схематическое изображение трансфекции нейронов с помощью катионных липосом

Схематическое изображение трансфекции нейронов с помощью катионных липосом

С целью повышения проницаемости ГЭБ пред­лагается ряд терапевтических средств, в частности назначение осмодиуретиков, циркуляция которых б крови приводит к «сморщиванию» эндотелиальных клеток. Проницаемость повышается в течение 5—15 минут после инфузии маннитола и нормали­зуется в течение 2 часов. Это приводит к эффек­тивной экспресии трансгенов в базальных гангли­ях и мозговой коре при использовании аденови­русного вектора и вируса простого герпеса.

На наш взгляд, использование осмодиуретиков в комплексе лечения повышенного внутричерепного давления при тяжелой ЧМТ может облегчать применение генной терапии. Другим средством повышения проницаемости ГЭБ служит использование аналогов брадикинина, в частности RMP-7, инфузия кото­рых приводила в ряде исследований к 12-кратному увеличению поступления терапевтических агентов вЦНС.

Другим способом доставки векторов в нервную ткань может быть их прямое введение в паренхиму головного мозга. Этот метод позволяет избежать пре­пятствия в виде ГЭБ и инактивации комплемен­том, его преимущества — низкая системная ток­сичность и использование небольшого количества вируса. После прямого введения аденовирусов или вируса простого герпеса в мозг трансфекция кле­ток наблюдалась в радиусе 2 мм вокруг места инъ­екции, что весьма значительно для мозга крыс, но не обеспечивает достаточную трансфекцию у че­ловека.

Введение вектора в цереброспинальную жидкость может вызвать экспрессию трансгенов в клетках эпендимы и сосудистых сплетений. Этот метод мо­жет обеспечить секрецию терапевтических белков в ликвор с последующим их проникновением в го­ловной мозг. Прямое введение аденовируса в боль­шую затылочную цистерну приводило также к трансферу генов в лептоменингеальные клетки, окутывающие магистральные артерии, адвентициальные клетки крупных сосудов и, реже, гладко-мышечные клетки мелких сосудов. По мнению за­рубежных ученых, применение вентрикулярных канюль у больных с тяжелой ЧМТ может быть использовано для введения комплексов липосомы ДНК.

Многообещающим методом является использо­вание нервных стволовых клеток (НСК) в качестве вектора для генной терапии. НСК представляют со­бой постоянный исходный источник клеток не­рвной ткани — нейронов, олигодендроглии, астроглии, и предназначены, вероятно, для пополне­ния популяций и субпопуляций клеток мозга в физиологическом (старение) и патологических процессах в организме человека и животного. С момента их открытия известно, что эти клетки яв­ляются «бессмертными», т.к. пополняя популяции нервных клеток, они «самовосстанавливаются».

Изолированные из тканей мозга НСК продолжают размножаться в условиях культивиро­вания in vitro в бессывороточной среде под воздей­ствием как эпигенетических, так и генетических факторов. В качестве эпигенетических факторов ис­пользуют воздействие на НСК EGF и FGF, а ге­нетическими факторами, которые воздействуют на НСК в условиях in vitro, являются гены v-myc и большой Т-антиген.

Важно отметить, что эти клетки, извлеченные из субвентрикулярной зоны головного мозга плода человека, в изолированном состоянии показали способность к дифференцировке в нейрональные и глиальньте клеточные линии, полностью проявив свою мультипотентность. При имплантации мы­шиных клонов НСК в желудочки мозга новорож­денных мышей клетки прививались в субвентрику­лярной герминативной зоне, а затем начинали миг­рировать к обонятельной луковице, превращаясь в нейроны.

E.Y. Snyder и соавторы имплантиро­вали также человеческие клоны НСК в боковой желудочек новорожденных мышей, где они интег­рировались в субвентрикулярную зону. Из этой зоны человеческие НСК затем интенсивно мигрировали или вдоль субкортикального белого вещества, или вдоль рострального миграционного тока (rostral migratory stream), как и мышиные НСК. При этом НСК давали такие же дифференцированные кле­точные клоны, как если бы это происходило при нормальном развитии головного мозга человека.

Современные исследования при эксперимен­тальной ЧМТпоказали, что при введении че­ловеческих нервных клеток-предшественников фетального происхождения в мозолистое тело крыс с повреждением в области гиппокампа отмечается от­четливая миграция этих клеток к месту травмы. Боль­шинство клеток, происходящих из этих предше­ственников, демонстрировало иммунореактивность глиальных маркёров, таких как виментин или глиальный фибриллярный кислый протеин, меньшая же часть — нейрональных маркеров, таких как кальбидин, парвальбумин или МАР2. Авторы считают, что дальнейшие исследования должны быть направлены на выяснение сигналов окружающих клеток, стимулирующих дифференциацию клеток—предшественников в нейроны in vivo, а также замещение погибших нейронов организма-реципиента.

Другие исследователи указывают, что природа таких сигналов в значительной степени распознана. Дифференцировка НСК в нейроны определяется кон­тактными и растворимыми факторами. Это слож­ный процесс, требующий взаимодействия между раз­личными клетками в течение нескольких дней. В тка­невых культурах определено, что НСК трансфор­мируются в синаптически активные нейроны под влиянием нейротрофинов, секретируемых глиальными клетками. При взаимодействии нейронов и глии нейротрофины активируют глутаматэргические и GABA-эргические синапсы.

Одним из направлений в использовании НСК является создание «бессмертных» клеточных линий путем генетической трансформации эмбриональ­ных предшественников, в частности с целью ин­дукции синтеза ими факторов роста. Перенос нейротрофических факторов клонами НСК в ткани зрелого мозга, встраивание самих клонов в уже су­ществующую цитоархитектонику мозга и продолжительная экспрессия этих факторов в поврежденных структурах головного мозга сулят боль­шие надежды на положительный эффект в лече­нии таких часто встречающихся заболеваний как тяжелая ЧМТ, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.

Другими исследованиями было показано, что клетки микроглии и астроглии, а также нейроны, могут возникать из стволовых клеток костного моз­га, являющихся нормальными клеточными ком­понентами костного мозга у взрослых индивидуу­мов. Доказано, что клетки нервной ткани и клетки крови имеют общую стволовую клетку, которая в зависимости от условий внешней среды способна превращаться в головном мозге в нервные клетки, а в костном мозге — в клетки крови. Миграция и дифференцировка клеток костномозгового проис­хождения после их внутривенной, интратекальной или интрапаренхиматозной имплантации в ткани головного мозга свидетель­ствуют о реальной возможности использования их при заболеваниях ЦНС.

Трансплантация эмбриональной нервной ткани в головной мозг пациента, наряду со множеством положительных эффектов, имеет также и недостат­ки, заключающиеся в необходимости исследования донорской эмбриональной нервной ткани на носительство ВИЧ, других вирусов и белков-прионов, не говоря об этических аспектах такой транс­плантации.

Уже сегодня можно предполагать, что пересадка в нервную систему стволовых клеток костного моз­га, взятых непосредственно у больного с тяжелой

МТ, может способствовать стимуляции процесса восстановления структуры, а затем и функций ЦНС. С помощью аутотранеллантации клеток костного мозга в головной мозг можно будет избежать недо­статков, присущих трансплантации донорской эм­бриональной нервной ткани. В последнее время по­явились сообщения о возможности выделения и последующего использования в терапии заболева­ний ЦНС стволовых клеток кожи и подкожного жира. Это позволяет избежать такой болезненной процедуры как пункция костного мозга и, в случае применения стволовых клеток подкожной жиро­вой клетчатки, получать значительно большее их количество.

С.А.Еолчиян, АА.Потапов, Ф.А.Ван Дамм, В.П.Ипполитов, М.Г.Катаев
Похожие статьи
  • 09.04.2013 35385 13
    Диффузные аксональные повреждения головного мозга

    К диффузным аксональным повреждениям головного мозга относят полные и /или частичные распростра­ненные разрывы аксонов в частом сочетании с мелко­очаговыми геморрагиями, обусловленные травмой преимущественно инерционного типа. При этом наи­более характерными территориями аксональных и сосудистых нар...

    Черепно-мозговые нарушения
  • 05.04.2013 33568 36
    Очаговые ушибы головного мозга

    К ушибам головного мозга относят возникшие в ре­зультате травмы очаговые макроструктурные повреж­дения его вещества.
    По принятой в России единой клинической класси­фикации ЧМТ очаговые ушибы мозга разделяют на три степени по тяжести: 1) легкие, 2) среднетяжелые и 3) тяжелые.

    Черепно-мозговые нарушения
  • 18.04.2013 22947 34
    Повреждения черепно-мозговых нервов

    Повреждения черепных нервов (ПЧН), нередко являются главной причиной инвалидизации боль­ных, перенесших черепно-мозговую травму. Во многих случаях ПЧН встречаются при легкой и среднетяжелой травме черепа и головного мозга, иногда на фоне сохраненного сознания (в момент травмы и после нее...

    Черепно-мозговые нарушения
показать еще
 
Нейрохирургия и неврология