Генная терапия при черепно-мозговой травме. Классификация

20 Апреля в 12:32 1044 0


Генная терапия — новая стратегия лечения с ис­пользованием методик переноса генетического ма­териала в клетки с лечебной целью, Генная тера­пия предполагает использование различных спо­собов доставки фрагментов нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), кодирующих определенный по­липептид, с целью экспрессии последнего в клет­ках организма — реципиента.

Протеин, запуск или усиление синтеза которо­го является целью применения генной терапии, может быть энзимом, структурным белком или выполнять другую функцию. Трансгенные протеи­ны могут быть гормонами, нейротрансмиттерами, частями цитоскелета, формировать ионные кана­лы, рецепторы. Энзимы участвуют в синтезе других белков и прочих биологически активных веществ, которые могут оставаться в клетке или секретироваться экстрацеллюлярно, действовать аутокринным, паракринным или эндокринным способом.

В 1997 году B.V. Zlocovic и M.L.J. Apuzzo вы­деляли 4 основных цели применения генной тера­пии при неврологических заболеваниях:

1) Транс­гены могут быть использованы для лечения нейро-дегенеративных заболеваний, обусловленных фер­ментной недостаточностью вследствие дефекта еди­ничного гена. Генная терапия может применяться для замещения функционирующего гена при ре­цессивных болезнях. При мутации доминантного гена использование метода может быть направлено на выработку антител к патологическому белку либо его рецептору, а также может включать примене­ние некоторых других методик;

2) Генная терапия может способствовать восполнению функции ут­раченных нейронов при нейродегенеративных за­болеваниях, ликвидируя дефицит нейротрансмиттеров, способствуя секреции нейротрофических факторов, рецепторов клеточной стенки, экспресии антиапоптозных генов;

3) Генная терапия при­меняется при лечении опухолей головного мозга. Примером может быть использование гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk), ко­торый будучи интегрированным в клеточный ге­ном делает клетку чувствительной к противовирус­ному препарату ганцикловиру. Последующее назна­чение ганцикловира приводит к гибели клеток, подвергшихся трансфекции HSV-tk;

4) Изучаются различные методики применения генной терапии при цереброваскулярной патологии.

Последние несколько лет характеризуются по­вышенным интересом к исследованию возможно­стей применения генной терапии при черепно-моз­говых повреждениях, увеличением числа экспери­ментальных работ в этой области, однако К. Yang и соавторы отмечают, что проблема остается далеко не изученной.

Классификация способов генной терапии

На основании данных, приведенных в литера­турных обзорах К. Yang и соавторы и С. Weil и соавторы, выделяют следующие виды генной терапии. Прежде всего, генная терапия может быть:

1) фетальной (germ line gene therapy), кото­рая предполагает перенос генов в зиготу с целью замещения генетического дефекта в последующих поколениях. Возможное клиническое применение этого метода сопряжено с целым рядом этических проблем;

2) соматической, предполагающей трансфекцию зрелых клеток или тканей.

Основываясь на различиях клеток-мишеней, воз­можны такие разновидности метода:
1) генная те­рапия ex vivo, включающая перенос генов в клетку in vitro с последующей имплантацией в живой орга­низм модифицированных клеток, содержащих не­обходимый ген. Трансфекции в данном случае мо­гут подвергаться либо собственные клетки реци­пиента, либо чужеродные;
2) генная терапия in vivo, предполагающая введение генного материала в ткани живого организма in situ.

В зависимости от особенностей применяемого вектора (переносчика генного материала) мето­ды трансфекции делятся на две главные катего­рии:

1) с использованием вирусных векторов;

2) с использованием невирусных векторов.

Предпосылки и цели применения генной терапии при черепно-мозговой травме

Развитию исследований в области генной терапии при черепно-мозговых повреждениях, в первую оче­редь, способствовало определение терапевтической роли специфических белков, так называемых нейротрофинов, при ЧМТ. Нейротрофины, относящи­еся к факторам роста, играют важную роль в раз­витии ЦНС, так как любая клетка для деления и дифференцировки нуждается в целом ряде экстрацеллюлярных сигналов в виде нейротрансмиттеров, гормонов и факторов роста.

Большинство из этих молекул (лигандов) представляет собой полипеп­тиды, связывающиеся специфически с рецептора­ми клеточной мембраны, что приводит к актива­ции внутриклеточного каскада других полипепти­дов (вторичные мессенджеры) и передаче сигнала в клеточное ядро. На примере мотонейронов показано, что у высших позвоночных эти клетки генерируются в избыточном количестве во время эмбрионального развития и затем значительное число их элиминируется. Во время постнатального развития и дальнейшей жизни популяция мотоней­ронов поддерживается нейротрофическими факто­рами, продуцируемыми скелетными мышцами и глиальными клетками.

Значительное число изученных факторов роста относится к различным известным семействам. Обнаружено, что в функционировании здоровой ЦНС и при ее патологии важную роль играет се­мейство рецепторов факторов роста, относящихся к тирозинкиназам. Рецепторы тирозинкиназных факторов роста представляют собой трансмембранные полипептиды с лиганд-связывающим доменом в экстрацеллюлярной части, гидрофобным транс­мембранным и внутриклеточным тирозинкиназным сегментами. Тирозинкиназный сегмент является ка­талитическим доменом, который фосфорилирует сначала рецептор, а затем один из нескольких внут­риклеточных субстратов.

Это активирует вторичную митогенную систему мессенджеров внутри клетки и, при продолжающейся стимуляции факторами роста, приводит к делению клетки. К тирозинки­назным рецепторам относятся эпидермальный фак­тор роста (EGF), тромбоцит-производный фактор роста (PDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор роста фибробластов (FGF), сосуди­стый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фак­тор роста нервов (NGF) и соответствующие лиганды, мозг-прозводный фактор роста (BDGF) и нейротрофин-3.

Отголоском структурной пластичности, наблю­дающейся при развитии ЦНС, может быть ответ взрослого головного мозга на травму. Указыва­ется, что повреждение нейронов может иметь одно из трех следствий: клеточную смерть, стой­кую атрофию нейронов или восстановление. Спо­собность зрелых нейронов к восстановлению мо­жет определяться механизмами, влияющими на нейрональный фенотип во время развития ЦНС и включающими экспрессию генов, кодирующих факторы роста, а также реакцию на сигналы кле­точного окружения. Такие сигналы представляют собой нейротрофины и молекулы-субстраты, сти­мулирующие рост аксонов.

Способность реагиро­вать на нейротрофические факторы демонстриру­ют несколько отделов взрослой ЦНС: базальные отделы переднего мозга, обонятельная кора, гиппокамп, таламус, ствол мозга и спинной мозг. Спе­цифичность реакций этих регионов на влияние нейротрофинов соответствует таковой в период разви­тия ЦНС.

Авторы приводят доказательства, что назначение нейротрофинов и субстратов, стиму­лирующих рост, крысам с экспериментальной ЧМТ способствовало частичному морфологическому и функциональному восстановлению. В качестве од­ного из эффективных средств доставки этих соеди­нений в ЦНС предлагается метод генной терапии.

Экспрессия генов, кодирующих синтез факто­ров роста, отмечается уже в первые часы после повреждения, однако для увеличения синтеза са­мих белков могут понадобиться дни.

К нейротрофическим факторам роста, оказыва­ющим положительный эффект при ЧМТ, М.Р. Mattson и S.W. Scheff относят, помимо вышеназва­ных NGF, BDGF, IGF, FGF и нейротрофина-3, также глия—производный нейротрофический фак­тор и интерлейкины (IL-1, 1L-6, IL-8). По мнению авторов, нейротрофины могут действовать путем влияния на свободнорадикально-кальциевые меха­низмы, уменьшая эффекты кальция. Нарушение по­ступления нейротрофических факторов во взрослую ЦНС не приводит обязательно к гибели клеток, как это отмечается в случае развития нервной системы, но непременно дестабилизирует нейроны, умень­шая их жизнестойкость и способность отвечать на повреждение, образовывать новые связи.

В литературе приводятся много­численные, полученные в ходе экспериментов in vivo, доказательства способности многих факторов роста защищать нейроны от повреждения вслед­ствие энергетического дефицита либо избытка глутамата или кальция. Использование NGF путем внутрижелудочковой инфузии способствовало 350% повышению выживаемости септальных холинергических нейронов при экспериментальной аксотомии. I. Mocchetti и J.R. Wrathall отмечали, что NGF, BDGF и нейротрофин—3 стимулируют рост аксонов, нужны для реорганизации поврежденной ЦНС, экспресии энзимов, необходимых для син­теза нейротрансмиттеров, что, по мнению авто­ров, может лежать в основе наблюдающегося в кли­нике значительного функционального восстанов­ления при отсутствии регенерации поврежденных нейронов через некоторое время после травмы.

По данным тех же исследователей, FGF не только под­держивает нейроны, но и стимулирует реваскуляризацию и определенные реакции глии на травму. Применение этого фактора в эксперименте также уменьшает эффекты вследствие аксотомии или воз­действия возбуждающих токсинов. Суммируя резуль­таты приведенных работ, можно заключить, что назначение нейротрофинов (в частности путем внутрижелудочковой инфузии или внутривенного введения, т.е. без использования методик генной терапии) экспериментальным животным с ЧМТ защищает холинэргические нейроны от смерти или дегенерации (известно, что ЧМТ приводит к утра­те холинэргических нейронов), уменьшению дефи­цита познавательной деятельности, регрессу нару­шений поведенческих реакций и памяти.

Исходя из этого, можно сформулировать следу­ющую цель генной терапии при ЧМТ — достиже­ние терапевтически полезных уровней экспрессии нейротрофинов в травмированной ЦНС путем при­менения генетических методик.

Следующей предпосылкой применения генной терапии при ЧМТ является доказанная зависимость последствий ЧМТ от индивидуальных генетических особенностей, в частности от АроЕ-генотипа, что может требовать специфической коррекции. Аполипопротеин Е (АроЕ) представляет собой со­единение, необходимое для поддержания жизне­способности отростков нервных клеток и тормозя­щее накопление в нервной системе белка амилои­да, аггрегация которого приводит к развитию бо­лезни Альцгеймера. В эксперименте, мыши, лишенные гена АроЕ, демонстрировали утрату аксо­нов и развитие нарушения поведенческих реакций по мере старения или при назначении возбуждаю­щих токсинов. АроЕ имеет несколько изоформ, причем в отличие от АроЕ е2 и АроЕ еЗ, изоформа АроЕ е4 в меньшей степени подавляет аггрегацию амилоида и менее способствует репарации аксо­нов. У мышей, несущих ген, кодирующий синтез АроЕ е4, отмечаются те же нарушения, что и при полном отсутствии данного гена.

Хотя общий синтез белка при Ч МТ часто умень­шается, ген АроЕ относится к тем генам, экспрес­сия которых и, следовательно, синтез соответству­ющего протеина наблюдаются в ответ на травма­тическое и ишемическое повреждение. Считается, что в данном случае АроЕ выполняет функцию ремоделирования липидов мембран глии и нейро­нов. Изучение зависимости исходов ЧМТ от особенностей АроЕ-генотипа показало, что часто­та неблагоприятных исходов (смерти и глубокой инвалидизации) значительно возрастает у лиц, несу­щих аллель АроЕ е2, по сравнению с АроЕ е4 — отрицательными больными даже в случае более лег­ких повреждений.

Данная зависимость особо заметна в более молодом возрасте, в частности у детей. Доказано, что очаги ушиба мозга при прочих рав­ных условиях (возраст, время от момента получе­ния травмы до выполнения компьютерной томог­рафии, тяжесть травмы, оцененная по шкале ком Глазго при поступлении) имеют большие размеры у пациентов с аллелем АроЕ е4.

В настоящее время считается доказанной связь на генетическом уровне между механизмами пато­генеза ЧМТ и болезни Альцгеймера, В мозге больных, умерших от ЧМТ, в 30 % случаев опре­деляется накопление амилоида — пептида, от­ветственного за образование характерных для бо­лезни Альцгеймера бляшек. Считается, что травма головного мозга может действовать как пуско­вой фактор острого депонирования амилоида в мозговой коре, что обусловлено, вероятно, реак­цией цитокинов. Эпидемиологические иссле­дования подтвердили связь между развитием бо­лезни Альцгеймера и перенесенной ранее ЧМТ, причем травма головы с потерей сознания и поступлением б лечебное учреждение считается важ­ным фактором риска болезни Альцгеймера.

Доказано, что главной генетической причиной это­го заболевания является наличие гена АроЕ е4, экспрессия которого не препятствует накоплению амилоидного белка и не способствует репарации аксонов. В то время, как у пациентов с отсут­ствием гена АроЕ е4 скопления амилоида после ЧМТ появляются только в 10 % случаев, при на­личии одной копии этого аллеля такая частота воз­растает до 35 %, а при наличии двух копий аллеля АроЕ е4 скопления амилоидного белка отмечаются у всех больных.

Понимание роли генетически обусловленных факторов, определяющих те или иные исходы и от­даленные (развитие болезни Альцгеймера) послед­ствия ЧМТ, позволяет так сформулировать следую­щую возможную цель генной терапии при черепно—мозговых повреждениях — противодействие ге­нетически обусловленным реакциям на травму, при­водящим к развитию каскада патологических изме­нений в нервной ткани и вторичным, часто нео­братимым, повреждениям ЦНС. В частности, пред­лагается назначение аполипопротеинов, ко­торые могут оказать в данном случае полезное тера­певтическое воздействие. Активация синтеза АроЕ s2 и еЗ в нервной системе может быть осуще­ствлена методами генной терапии или транспланта­ции клеток, секретирующих эти продукты.

Еще одной предпосылкой применения генной терапии при ЧМТ может служить повышение про­ницаемости гематоэнцефалического барьера при травме, что может облегчить доставку в головной мозг трансгенов с помощью векторов, доступ ко­торых в ЦНС в других условиях ограничен.

С.А.Еолчиян, АА.Потапов, Ф.А.Ван Дамм, В.П.Ипполитов, М.Г.Катаев

Похожие статьи
  • 09.04.2013 35216 13
    Диффузные аксональные повреждения головного мозга

    К диффузным аксональным повреждениям головного мозга относят полные и /или частичные распростра­ненные разрывы аксонов в частом сочетании с мелко­очаговыми геморрагиями, обусловленные травмой преимущественно инерционного типа. При этом наи­более характерными территориями аксональных и сосудистых нар...

    Черепно-мозговые нарушения
  • 05.04.2013 33335 36
    Очаговые ушибы головного мозга

    К ушибам головного мозга относят возникшие в ре­зультате травмы очаговые макроструктурные повреж­дения его вещества.
    По принятой в России единой клинической класси­фикации ЧМТ очаговые ушибы мозга разделяют на три степени по тяжести: 1) легкие, 2) среднетяжелые и 3) тяжелые.

    Черепно-мозговые нарушения
  • 18.04.2013 22732 34
    Повреждения черепно-мозговых нервов

    Повреждения черепных нервов (ПЧН), нередко являются главной причиной инвалидизации боль­ных, перенесших черепно-мозговую травму. Во многих случаях ПЧН встречаются при легкой и среднетяжелой травме черепа и головного мозга, иногда на фоне сохраненного сознания (в момент травмы и после нее...

    Черепно-мозговые нарушения
показать еще
 
Нейрохирургия и неврология