Примеры важнейших хелатов в биохимии

20 Июля в 23:37 5966 0


В качестве примера влияния компонентов хелатов на их функцию рассмотрим нуклеиновые кислоты, а также порфириновые, азометиновые и аминокислотные циклические соединения с разными металлами.

Нуклеиновые кислоты

Одними из важнейших хелатов для жизнедеятельности всех живых организмов являются нуклеиновые кислоты (НК). В дезоксирибонуклеиновых (ДНК) и рибонуклеиновых (РНК) кислотах закодирована вся информация, необходимая для развития живого организма; в процессе жизнедеятельности на ее основе происходит синтез всех белков организма из стандартного набора аминокислот.

Основная масса НК сосредоточена в ядрах клеток в составе нуклеопротеинных комплексов, называемых эу- и гетерохроматином. Строение НК очень простое. Скелет гигантских макромолекул составляют полиэфиры фосфорной кислоты и одного из двух пятиуглеродных сахаров — D-рибозы в составе РНК и 2-дезокси-D-рибозы в составе ДНК. Боковые ответвления образованы гетероциклическими основаниями, присоединенными к углеводным компонентам. Их пять: 2 пуриновых — аденин (А) и гуанин (Г) и 3 пиримидиновых — цитозин (Ц) и тимин (Т) в ДНК, и Ц и урацил (У) в РНК (рис. 1).

Строение НК и оснований

Рис. 1. Строение НК и оснований

Таким образом, вся молекула НК состоит из чередующихся в различной, но строго определенной последовательности 4 мономерных единиц (нуклеотидов). Они различаются только азотистыми основаниями. Последовательность из 4 нуклеотидов образует структуру первого порядка — первичную структуру НК. Рентгеноструктурные исследования НК показали, что полимерная цепочка молекулы НК любого происхождения закручена в спираль диаметром 2 нм с длиной витка 3,4 нм, так что каждый виток спирали содержит 10 нуклеотидов.

В 1953 г. Д. Уотсон и Ф. Крик, исходя из данных рентгеноструктурного анализа, предложили модель вторичной структуры НК. Для её построения была необходима «главная идея XX века в биологии» - идея матричного размножения биологических макромолекул, автором которой был один из выдающихся биологов того времени Н.К. Кольцов (Шноль, 2010). Без этой идеи невозможно было бы понять структуру молекулы ДНК и предложить её модель. Согласно ей, ДНК образует двуспиральную структуру, стабилизированную водородными связями между азотистыми основаниями, направленными внутрь спирали. При этом водородные связи образуются только между комплементарными парами пиримидин-пурин, то есть Т всегда соединен с А (двумя водородными связями), а Ц или У — с Г (тремя). Эта закономерность объясняется тем, что пара пурин-пурин образовала бы между двумя спиралями слишком длинный мостик, а пиримидин-пиримидин — слишком короткий (рис. 2).

Спаривание оснований А-Т и Г-Ц

Рис. 2. Спаривание оснований А-Т и Г-Ц

Установлено, что плоскости колец азотистых оснований взаимно параллельны и перпендикулярны оси молекулы, а углеводные кольца расположены в плоскостях, параллельных оси спирали и перпендикулярных азотистым основаниям. Таким образом, вторичная структура ДНК представляет собой жесткое двуспиральное образование. Нити ДНК в ядрах клеток навиты на октамерные комплексы структурных белков гистонов и организованы в структурных единицах хроматина — нуклеосомах. В отличие от гигантских молекул ДНК, более короткие единичные нити молекул РНК становятся двуспиральными благодаря водородным связям, которые местами «завиваются» сами на себя. Затем эти образования сворачиваются в клубок, образуя третичную структуру. Ее конфигурация во многом зависит от окружающей среды, главным образом, от присутствующих ионов металлов.

Как и белки, все НК встречаются в природе только в одной оптической форме. Оптических изомеров НК не обнаружено. Это говорит о существенном значении формы молекулы для ее нормального функционирования в организме. При первых же исследованиях состава НК самого разного происхождения в них были выявлены практически все обычные микроэлементы (Mg, Мп, Са, Zn, Fe, Си и др.), и даже несколько редко обнаруживаемых (Сr, Ni, Sr, Ва, Al, V). В результате очень тщательных экспериментов было выяснено, что эти элементы не являются «примесями». Содержание металлов соответствует постоянным стехиометрическим отношениям к числу мономерных единиц НК. Оно равно для РНК 1:50, а для ДНК 1:150 (Терентьев с соавт., 1968). Были испробованы все обычные методы удаления слабо связанных металлов, например, диализ при разных рН или с подходящими комплексообразующими агентами, и даже переосаждение из растворов, но полностью удалить металлы из состава НК не удалось.

Таким образом, структурно НК представляют собой полидентантные лиганды, где металл имеет «право выбора» своего лиганда между фосфатной, углеводной и азотистой группами. Исследования участков внедрения металлов в НК с помощью методов УФ, ИК-спектроскопии, ЯМР, ЭПР показали, что все металлы можно довольно четко разделить на 2 группы.

Металлы первой группы (Mg, Са, Ва, Sr, Zn, Мп, Ni, Со) связаны электростатическими силами с отрицательно заряженными фосфатными группами. Однако соотношение М:Р отличается от 1:1 и зависит от соотношения А-Т : Г-Ц. Чем больше Г-Ц, тем больше в составе НК связанных металлов. Этот факт легко объяснить тем, что у пары Г-Ц имеются три водородные связи, а у пары А-Т — только две (рис. 3). Поэтому ионы металлов находят в Г-Ц больше участков связывания с основаниями, чем в А-Т. Простое сравнение структур азотистых оснований показывает, что Г напоминает по своему строению 8-оксихинолин — комплексон, обычно используемый в качестве реактива благодаря образованию прочных хелатов с металлами (рис. 3).

8-Оксихинолин и гуанин

Рис. 3. 8-Оксихинолин и гуанин

Поскольку фосфатные группы одной и той же молекулы НК расположены от амино- или окси-групп азотистых оснований слишком далеко, они взаимодействуют с соответствующими группами второй спирали, обеспечивая таким образом стабилизацию двуспиральной структуры ДНК в присутствии ионов металлов.

Итак, металлы первой группы связаны электростатическими силами с отрицательными фосфатными группами, и частично — координационными, через амино- или окси-группы, с азотистыми основаниями (донорно-акцепторной связью, различной силы в зависимости от природы металла). При этом образуются особо прочные пятичленные хелатные узлы (ХУ), соединяющие две спирали.

Вторая группа металлов (Си, Cd, Hg, Pb, Ag, Fe), в соответствии со своими комплексообразующими свойствами, образует прочные хелаты с азотистыми основаниями. Эти металлы обладают повышенным по сравнению с кислородом сродством к азоту. Фосфаты образуют лишь дополнительные связи по остаточным координационным участкам. Каждый из металлов, в зависимости от природы и состояния НК, поступает в определенные наиболее подходящие для него участки молекулы НК, и может выполнять в образовавшейся структуре различные функции.

Обычно основными показателями состояния вторичной структуры ДНК служат величина оптической плотности раствора (ее увеличение коррелирует с процессом деспирализации) и значение температуры плавления (переход нативной ДНК в денатурированную). Стабилизация структуры внешне проявляется уменьшением оптической плотности и увеличением температуры плавления.

Металлы первой группы повышают температуру плавления от 63° до 80°С, причем стабилизирующий эффект прямо пропорционален концентрации металла. Стабилизация двуспиральной структуры ДНК происходит благодаря связыванию металлов с фосфатными группами и уменьшению электростатического отталкивания из-за нейтрализации отрицательных зарядов. При охлаждении все исходные параметры восстанавливаются. Другой возможный тип стабилизации вторичной структуры — дополнительное к водородным связям образование межнуклеотидных мостиков через металл от фосфата к азотистому основанию соседней спирали.

Эффект дестабилизации НК металлами второй группы прямо противоположный. В присутствии Си величина tпл ДНК уменьшается до 42°С, но при охлаждении оптическая плотность существенно не снижается. Вероятно, ионы Си разрушают водородные связи, замещая их при взаимодействии с электроннодонорными группами оснований нуклеотидов. Дело в том, что Н, осуществляющий связь аминогруппы А, пространственно мешает хелатированию, так как лежит в плоскости хелатного узла и затрудняет подход металла для образования пятичленного ХУ. Устранение этого препятствия требует поворота аминогруппы на 90° вокруг оси C-N и, следовательно, разрыва водородной связи между А и комплементарным ему Т. Такое превращение препятствует восстановлению водородных связей при охлаждении, и процесс денатурации становится необратимым. Подобное влияние оказывают также Cd, Hg и Ph. При этом они могут встраиваться непосредственно в водородную связь вместо , Нобразуя прочные хелаты с ковалентной связью (рис. 4).

Хелатирование ДНК металлами второй группы

Рис. 4. Хелатирование ДНК металлами второй группы

Поведение Fe различается в зависимости от валентности. Крупные ионы Fe2+ (радиус 82 пм) увеличивают tпл ДНК, но оптическая плотность раствора при охлаждении не снижается. Объясняется этот эффект начальным связыванием с фосфатом, что приводит к стабилизации по электростатическому механизму, т.е. Fe2+ нейтрализует отрицательные заряды фосфатных групп. Это проявляется повышением tпл. При дальнейшем нагревании и разрыве водородных связей Fe2+ образует хелат с основанием нуклеотида с образованием ковалентных связей, в результате чего его радиус возрастает до 116,5 пм. При охлаждении система водородных связей восстановиться не может. То есть Fe2+ из-за экранирования хелатными узлами тех участков пуринов и пиримидинов, которые обычно спариваются водородными связями, стабилизирует денатурированное состояние ДНК.

В отличие от двухвалентных, меньшие по размеру трехвалентные ионы Fe3+ (радиус 67 пм) внедряются в участках водородных связей, образуя между 2 цепями ДНК хелатные мостики, что стабилизирует двуспиральную структуру. Поэтому при охлаждении ионы Fe3+ эти участки не экранируют, и водородные связи восстанавливаются.

Из этого примера видно, что состояние металла может иметь большое значение для регуляции процессов репликации ДНК в делящейся клетке. Степень окисленности ионов Fe и их противоположная роль в этих процессах зависит от активности ферментов антиоксидантной системы, и поэтому молекулярные механизмы процессов репликации ДНК можно оценить только с учетом содержания в организме металлов и их природы.

Отмеченные особенности связи НК с разными металлами, естественно, проявляются в их функционировании, в частности, в процессах репликации ДНК в фазе G1 и в фазе G2, когда перед вхождением в фазу митоза происходит контроль полноты репликации. Присутствие в клетке в этих фазах металлов второй группы может извратить нормальные процессы репликации, репрессии и активации генов. Более того, под влиянием металлов многие гены необратимо выключаются, то есть теряют способность к транскрипции и никогда впоследствии не экспрессируются. В ряде случаев взаимодействие металлов с ДНК может изменить природу синтезируемых белков, подобно мутации. Наглядно этот механизм можно представить следующим образом (рис. 5).

Схема изменения репликации ДНК металлами

Рис. 5. Схема изменения репликации ДНК металлами

В норме процесс репликации ДНК состоит из инициации и синтеза цепей ДНК, терминации, взаимодействия с белками хромосом, рекомбинации и репарации ДНК. Расплетание цепи ДНК начинается после того, как ферментная система геликазы связывается со специфической последовательностью нуклеотидов, формируя репликационную вилку. Сразу же за ней по обнажающимся цепям продвигается ДНК-полимераза, которая их реплицирует (схема «А», Гринстейн, 2004).

В присутствии металлов второй группы процесс извращается. На схеме «Б» видно, что хелат М с остатками А и Т не позволяет цепям ДНК расплетаться, и тем самым останавливает репликацию. На схеме «В» показана ветвь спирали ДНК, хелатированная ионом металла; эта ветвь из процесса полимеризации исключается. Цепь ДНК укорачивается на некоторое число нуклеотидов, то есть один или несколько фрагментов Окадзаки ДНК-полимераза пропускает (Леменовский, 1997). В результате два ранее удалённых друг от друга участка ДНК пространственно сближаются. Так как возможность репликации не исчезает, получается ДНК с измененной последовательностью нуклеотидов и в системе передачи структурной информации с помощью РНК синтезируется аномальный белок, как будто произошла мутация (рис. 6).

Схема репликации ДНК

Рис. 6. Схема репликации ДНК (www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/)

Очевидно, что процессы репликации НК зависят не только от фазы клеточного цикла, но и того, в какой ткани они происходят. Высокодифференцированные нейроны или кардиомиоциты у взрослых людей обычно находятся в фазе клеточного цикла G0, когда их деление приостановлено и не возобновляется. В этой фазе клетки экспрессируют белки, используемые не для клеточного деления. Эти белки могут по-разному координироваться имеющимися металлами, от чего их регуляторные функции изменяются и не могут контролироваться рецепторами, локализованными вне или внутри мембран клеток.

Если учесть, что разные металлы влияют на активацию или репрессию генов неодинаково, образующийся в итоге репликации ДНК белок может значительно отличаться от нормального. Подобный механизм может действовать и в активно делящихся клетках. При этом не происходит мутаций или генных нарушений, а лишь под влиянием содержащихся в клетке металлов изменяются процессы декодирования, транскрипции, репликации и трансляции. Состав и соотношение металлов, в свою очередь, зависят от присутствующих в организме эндогенных или экзогенных лигандов, в том числе лекарственных, и от проницаемости мембран для них.

Порфирины

Выше мы уже упоминали значительную роль металлов в широко известных и чрезвычайно биологически важных хелатах - гемоглобине, гемоцианине и хлорофилле. Во всех трех случаях лиганд практически один и тот же — тетрадентантный порфирин, и различаются они заместителями. Однако металлы-комплексообразователи у них разные — соответственно, Fe, Си, Mg — поэтому различается цвет хелатов: красный, голубой, зеленый. Красный гемоглобин и голубой гемоцианин — переносчики O2 и CO2 в крови, соответственно, животных и моллюсков, зеленый хлорофилл — основной источник получения водорода из воды с помощью солнечной энергии в результате биофотолиза и использования протона для синтеза органических соединений. Добавим, что в чёрной крови асцидий O2-переносящий порфирин координирован ещё одним переходным металлом V.

К этой группе хелатов можно отнести и тетрапиррольный корриновый цикл, в котором связь между одной парой пиррольных колец реализована без метиленового мостика, имеющегося у порфиринов. Этот цикл, координированный ионом Со2+, называется «витамином В12» (кобаламин). Кобаламин синтезируется кишечной микрофлорой. Он служит коферментом при конверсии метилмалонил-КоА в сукцинил-КоА, при биосинтезе метионина из гомоцистеина, при восстановлении рибонуклеотидов до дезоксирибонуклеотидов. То есть Со необходим для осуществления важнейших метаболических процессов, связанных с усвоением Fe.

Из ферментов, содержащих витамин В12, наиболее известна метилмалонилмутаза. Ее недостаточность проявляется пернициозной анемией. Развитие недостаточности этого фермента, по-видимому, сопровождается восстановлением Со(II) до Со(I). Последний, будучи сильным нуклеофилом, ковалентно связывает метильную группу и переносит её на другие атомы.

Свойства порфириновых хелатов, содержащих Fe и Си, позволяют им выполнять в метаболизме важнейшую роль переносчиков простых лигандов типа O2 и СO2 или электронов в ферментах дыхательной цепи и в терминальных оксидазах.

Азометины и аминокислоты

К азометинам относятся такие широко известные вещества, как ванилин и другие основания Шиффа. о-Ванилин является промежуточным продуктом реакций дезаминирования, переаминирования и окисления α-аминокислот до α-кетокислот, а также модификации катехоламинов. Он отличается от салицилового альдегида наличием в бензольном кольце альдегидного компонента азометина группы -ОСН3. Эта группа повышает электронную плотность на атоме кислорода фенольной группы, увеличивая степень координации связи металл-лиганд. Растворимость хелатов на основе о-ванилина в неполярных растворителях выше, поэтому они легче проникают через мембраны клеток (рис. 7).

Салициловая кислота и о-ванилин

Рис. 7. Салициловая кислота и о-ванилин

Хелаты салициловой оксикислоты (ее эфир с уксусной кислотой — ацетилсалициловая кислота = «аспирин») имеют в метаболизме большое значение, поэтому широко применяются для лечения разнообразных заболеваний. Например, ацетилсалициловая кислота — наиболее широко применяемое во всем мире лекарство. В организме она инактивирует гемсодержащую простагландин-синтазу путем ацилирования остатка серина вблизи активного центра фермента, перекрывая подход к нему арахидоновой кислоты (20:4) и тем самым подавляя синтез простагландина Н2. При этом на некоторое время прерывается действие медиаторов, в данном случае эйкозаноидов, что объясняет болеутоляющее, жаропонижающее и антиревматическое действие препарата (рис. 8).

Механизм действия аспирина

Рис. 8. Механизм действия аспирина

Исследование токсичности азометиновых и аминокислотных хелатов Си, Со, Cr, Zn, Cd, Sn с помощью количественного альготеста (Барашков, Киристаева, 1977) показало, что, в зависимости от очень незначительных изменений в молекуле лигандов, изменяющих конформацию хелатов, токсичность одного и того же металла в расчете на атом меняется на 2-3 порядка. Например, если принять за единицу токсичность тетраэдра (трет-бутилсалицилалимин меди), то токсичность искаженного тстраэдрического металлоцикла (пропилсалицилалимин меди) удваивается, а у квадрипланарного металлоцикла (бутилсалицилалимин меди), наоборот, уменьшается в 20 раз. Можно сказать, что, чем сильнее электроннодонорные группы в молекуле лиганда, тем токсичнее соединение. Напротив, ввод в аминную компоненту азомети-на электроноакцепторной группировки резко снижает токсичность соединения (табл. 1).

Таблица 1. Токсичность металлоциклов меди

Алкилпроизводные хелаты

Заместитель

Строение хелата

Токсичность

R1

R2


Тс

Плоский

0,080

-СН3

4Н9

-СН(СН3)2

-С(СН3)3

-СН(СН3)2

-СН3

4Н9

- С6Н5

-ОСН3

-ОСН3

»

0,076

»

0,071

Искаженный тетраэдр

1,89

»

1,35

»

1,10

»

1,73

»

2,64

Общая формула алкилпроизводных хелатов

Общая формула алкилпроизводных хелатов

Арилпроизводные хелаты

Заместитель R

Тс

0,50

-ОСН3

2

0,32

0,072

Общая формула арилпроизводных хелатов

Общая формула арилпроизводных хелатов

Таким образом, биологическая активность комплексов обусловливается электронным донорно-акцепторным взаимодействием, и поэтому зависит от структуры соединения, природы связи металл-лиганд, природы атома комплексообразователя (металла), констант устойчивости хелатов. Их токсичность и, по-видимому, проницаемость для них биологических мембран усиливаются при введении в орто- и пара-положение к донорным атомам лигандов электроннодонорных группировок.

Выявлен важный факт: биологическая активность кластеров (биметаллических соединений) зависит от структуры соединения в целом, а не от компонентов кластера. Токсичность разнолигандных хелатов, в которых лигандами являются азометин и аминокислота, заметно отличается от токсичности монолигандных хелатов, составляющих кластер (табл. 2).

Таблица 2. Токсичность кластеров и разнолигандных хелатов меди

Токсичность кластеров и разнолигандных хелатов меди

Это означает, что биологическое действие хелата зависит от проницаемости комплекса в целом. Механизм взаимодействия подобных хелатов и кластеров со структурами мембран пока неясен. По степени влияния на токсичность хелатов с одинаковыми лигандами металлы можно расположить в следующем порядке: в ряду бис-(диокса)-хелатов — Cd>Cu>Co>Zn>Сr, а в ряду бис-(азатиа)-хелатов — Cd>Cu>Zn>Ag>Pb>Co (Рухадзе, Барашков, 1978; Барашков с соавт., 1979).

Эти особенности комплексных соединений необходимо принимать во внимание и при назначении больным, и при разработке лекарств. Небольшие модификации биологически активных молекул могут значительно повлиять на растворимость, проницаемость, константу устойчивости, и тем самым — на физиологические свойства полученных соединений. Механизмы комплексообразования в водных и неводных растворах неодинаковы, то есть в липофильном слое мембран комплексы с металлами образуются не так, как в гидрофильных участках. От этого могут измениться и активность рецепторов, и дальнейшая судьба комплексов.

Медицинская бионеорганика. Г.К. Барашков

Похожие статьи
  • 20.07.2012 73651 44
    Типы химических связей

    Каждый атом обладает некоторым числом электронов. Вступая в химические реакции, атомы отдают, приобретают, либо обобществляют электроны, достигая наиболее устойчивой электронной конфигурации. Наиболее устойчивой оказывается конфигурация с наиболее низкой энергией (как в атомах благородных газов&...

    Бионеорганика
  • 21.07.2012 19250 16
    Ионные насосы

    Ионными насосами называют молекулярные механизмы, локализованные в мембране и способные транспортировать вещества за счет энергии, высвобождаемой при расщеплении АТФ, или любого другого вида энергии.

    Бионеорганика
  • 19.06.2012 17042 20
    1 группа (1А подгруппа) — щелочные металлы (главная группа)

    В нее входят Li, Na, К, Rb, Cs, Fr (табл. 1 и 2). По многим химическим свойствам несколько отличается от других щелочных металлов Li+, имеющий диагональное сходство с Mg2+.

    Бионеорганика
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы