Диапазон содержания тяжелых металлов в цельной крови у жителей центральной России

02 Августа в 23:20 2619 0


Элементный анализ тканей человека, прежде всего цельной крови, можно считать первой ступенью анализа. Его достаточно, например, для обнаружения токсинов и выбора антидота при отравлениях, а также для подтверждения диагноза заболеваний с явно выраженными нарушениями МЛГ, например, болезни Вильсона-Коновалова (болезнь от нарушения обмена Си). Как правило, в этом случае полученные абсолютные результаты сравнивают с табличными значениями ПДК, устанавливая тем самым избыточное или недостаточное содержание элемента у пациента.

В табл. 1 приведены результаты статистической обработки результатов анализа цельной крови у 166 пациентов. В выборку попали данные по 25 элементам, содержание которых было выше предела обнаружения на используемом приборе. Они характеризуют «норму» для населения центра России. Однако достаточно ли информации, получаемой по абсолютным значениям? Ведь в нормативах ПДК не отражается специфика физиологического действия разных химических форм элементов. Например, онкогенный Cr(VI) значительно токсичнее Сr(III), однако в организме он сравнительно быстро восстанавливается до 3-х-валентной формы. Следовательно, при сравнении результатов анализа с ПДК без учета природы фактического комплекса этого металла и состояния иммунной системы можно придти к ложному выводу об отравлении этим металлом. ПДК не учитывает, что при физиологическом pH ионы металлов не находятся в свободном виде. В то же время смена валентности, как известно, сопровождается изменением размера иона металла и стереохимических особенностей образуемых им металлсодержащих комплексов, что приводит к изменению его физиологических функций.

Таблица 1. Диапазон абсолютного содержания МЭ в цельной крови жителей центральной России (в ppm = мг/л, при ± 95% доверительном интервале - ДИ)



Среднее

-95% ДИ

95% ДИ

1

Аl

0,056

0,040

0,073

2

Ва

0,021

0,010

0,031

3

Са

41,33

38,99

43,66

4

Cd

0,014

0,011

0,016

5

Со

0,007

0,006

0,009

6

Сг

0,014

0,009

0,019

7

Сu

0,62

0,57

0,67

8

Fe

287

266

308

9

Ge

0,44

0,39

0,48

10

К

1023

961

1085

11

Li

0,002

0,001

0,003

12

Mg

22,0

20,4

23,6

13

Mn

0,009

0,005

0,014

14

Mo

0,001

0,000

0,002

15

Na

1283

1209

1356

16

Ni

0,015

0,005

0,025

17

Pb

0,054

0,040

0,068

18

Si

0,68

0,44

0,92

19

Sr

0,059

0,035

0,082

20

Ti

0,031

0,006

0,067

21

V

0,077

0,071

0,084

22

W

0,029

0,020

0,038

23

Zn

3,8

3,5

4,1

24

P

266,2

251,0

281,4

25

S

1043

992

1093

Общепринятая практика выражения результатов анализов в единицах СИ (т.е. в молях/л) или в массовых аналитических единицах (т.е. в г/л), также может приводить к ошибкам. В обоих случаях концентрация выражается в расчете на объем биологической жидкости (кровь, плазма, моча и т.д.). Однако у разных людей, особенно при заболеваниях, гематокрит крови или плотность плазмы и мочи могут значительно разниться. Вследствие этого сухая масса 1 мл цельной крови у разных людей различается в среднем примерно на 20%, и эти различия остаются не учтёнными.

Кроме того, ошибки при определении содержания МЭ возникают вследствие большого количества других факторов:

  1. Метода анализа (весовой, фотоколориметрия, спектрометрия, масс-спектрометрия);
  2. Приборного обеспечения, чистоты реактивов и качества стандартов для калибровки;
  3. Процедуры взятия проб (содержание МЭ в крови пациентов, полученной в положении лежа или сидя, может различаться примерно на 15%). Это значит, что ошибка определения может колебаться от 0 при противоположных знаках до 35% при их совпадении; и это — только различия в зависимости от условий получения пробы;
  4. Способов пробоподготовки (сухое или мокрое озоление, в открытых тиглях, в колбах Кьельдаля, в автоклавах, в микроволновых печах);
  5. Квалификации персонала, учета взаимовлияния элементов и пр.

Последний пункт оказывается при проведении многоэлементного анализа основным, но во многих случаях именно его игнорируют. При оценке возможной ошибки анализа следует разделять ошибки при собственно анализе и при доанализных манипуляциях (получение проб, доставка в лабораторию, первичная обработка проб, пробоподготовка, чистота реактивов и посуды). Разброс аналитических данных обычно не превышает 1% (чаще — не более долей %). Погрешности, вносимые манипуляциями с пробами перед анализом, могут достигать сотни %.

Итак, сравнивать абсолютное значение содержания МЭ с ПДК некорректно. Кроме того, сложно оказывается сопоставлять результаты анализов абсолютного содержания МЭ, полученные в разных лабораториях. Приемлемой альтернативой может стать выражение результатов многоэлементных анализов в виде соотношения элементов. Такой прием нивелирует отмеченные ошибки вплоть до их исключения. Этот этап можно назвать второй ступенью анализа, без которой результат можно считать неполным.

Выпускаемые в настоящее время приборы (высокочастотные индуктивно-связанные масс-спектрометры — ИСП-МС) высокочувствительны и позволяют определять почти все элементы периодической системы в очень малых количествах образца, до нескольких мг ткани или мкл биологических жидкостей. Это облегчает получение материала для анализа, но одновременно и увеличивает риск ошибки вследствие неоднородности распределения элементов в тканях организма. В этих обстоятельствах практически единственным решением, позволяющим получить точные количественные данные, оказывается выражение результатов анализа в относительных единицах, по соотношению полученной концентрации элемента к таковой реперного элемента.

Таким элементом в силу нескольких обстоятельств не может быть щелочной или переходный металл. Переходные металлы встречаются в малых количествах, что вызывает технические трудности при их определении. Напротив, щелочные металлы содержатся в крови в больших количествах и с большой амплитудой диапазона концентраций, что при спектрохимических методах анализа приводит к неоднородности спектральных наложений. Несмотря на действие в здоровом организме эффективных механизмов поддержания гомеостаза главных щелочных металлов (Na и К), абсолютные значения их концентраций изменчивы, и зависят от множества трудноучитываемых внешних факторов. Например, диапазон концентраций этих элементов в крови россиян в норме находится в пределах, соответственно, 1209-1356 и 961-1085 мг/л. Кроме того, закономерности распределения щелочных металлов и полуметаллов между плазмой и цельной кровью прямо противоположны таковым для переходных металлов и большинства неметаллов. А именно: чем больше радиус иона металла, тем выше его содержание в клетках крови. У переходных металлов и неметаллов все наоборот — чем больше радиус иона, тем выше его содержание в плазме (Барашков с соавт., 2003а).

Лучше всего в качестве реперного элемента использовать щелочноземельные металлы — Са и Mg. Вероятно, для оценки выраженности заболеваний в ряде случаев можно использовать Mg, но для большинства остальных случаев таким элементом, по нашему мнению, должен быть кальций (Са). Основания для такого выбора следующие:

1. Содержание Са в организме из всех МЭ наибольшее, достигая 1 кг (25 моль). Хотя около 99% металла находится в костной ткани, оставшегося 1% вполне достаточно для надежного определения в остальных тканях. Содержание Са в цельной крови человека составляет, независимо от возраста и пола, несколько десятков ррт;

2. Са является основным неорганическим посредником — «мессенджером» и играет в обмене веществ чрезвычайно важную роль. Причем этот обмен протекает очень активно. Внеклеточный пул Са в течение суток обновляется примерно 33 раза, проходя через почки, кишечник и кости. В организме металл выполняет не менее 4 функций: структурную, нервно-мышечную, ферментативную, сигнальную (Маршалл, 2000).

Прежде всего, роль Са связана со структурной функцией (кости, зубы). Кости состоят из остеоида — коллагенового органического матрикса, в котором откладываются комплексные неорганические гидратированные соли, известные как гидроксилапатиты или карбонатапатиты. Они образуют кристаллическую решетку костной ткани на основе апатита (катион Са[Са3(РO4]32+) — соответственно, Са10(РО4)6(ОН)2 и Са10(РО4)6СО3. Независимо от того, продолжается или закончен рост организма, кости сохраняют высокую биологическую активность. Резорбция с помощью остеокластов постоянно сменяется образованием новой костной ткани при участии остеобластов. Этот процесс регулируется местными цитокинами и катализируется щелочной фосфатазой (ЩФ), которая отщепляет фосфат от пирофосфата. ЩФ секретируется остеобластами. В организме кости играют роль депо Са, P03-4, а также Mg и Na. Зубы отличаются от костей наличием в белковом матриксе, помимо коллагенов, протеогликанов (гликозаминогликанов).

Влияние Са на нервно-мышечную активность имеет особое значение в развитии симптоматики гипо- и гиперкальциемии. Нейромышечная функция включает в себя контроль процессов нервно-мышечной возбудимости, выделение нейротрансмиттеров (кальцитонин — йодсодержащий гормон С-клеток щитовидной железы, участвует в гомеостазе Са) и инициацию мышечного сокращения (АТФ-зависимый кальциевый насос). Уровень Са2+ в цитоплазме нестимулированной клетки очень низкий (10-100 нМ), поскольку ион цитотоксичен. Этот низкий уровень поддерживается Са-АТФазами. При быстрой деполяризации мембран во время прохождения импульса и образования потенциала действия концентрация Са2+ в цитоплазме в результате открытия Са-каналов в мембранах саркоплазматического ретикулума (СР) резко повышается до 1000 нМ. Пузырьки СР способны удалять Са2+ из цитоплазмы даже против градиента его концентрации при действии вышеназванного насоса в период после импульса (фактор релаксации), потребляя свободную энергию гидролиза АТФ.

Также важную роль Са играет в обеспечении ферментативной активности — как кофермент факторов свертывания крови. Этот процесс происходит следующим образом: растворимый белок плазмы фибриноген с помощью фермента тромбина превращается в нерастворимый фибриновый полимер. Из него с помощью глутаминтрансферазы благодаря образованию изопептидных связей боковых цепей аминокислот фибрина формируется нерастворимый фибриновый сгусток (тромб). Независимо от пути запуска, при свертывании (вне- или внутрисосудистом) развивается каскад протеолитических реакций, для которых необходимы Са2+ и фосфолипиды. В частности, тромбин активируется только в присутствии Са2+, а без него свертывания крови не происходит.

Видную роль играет Са в своей сигнальной функции, как внутриклеточный вторичный мессенджер. Действие иона опосредовано специальными Са2+-связывающими белками — «кальциевыми сенсорами», например, кальнексином, кальмодулином, кальретикулином, тропонином. При связывании иона эти белки переходят в активную форму и взаимодействуют с другими белками. Са2+ в этом случае влияет на активность ферментов и ионных насосов, а также на структуру компонентов цитоскелета (Кольман, Рём, 2000).

Концентрация Са2+ в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) довольно высокая — около 5 мМоль. Как известно, в ЭР синтезируются секреторные и мембранные белки, которые затем свертываются с образованием правильной трехмерной структуры. Этот процесс включает в себя образование дисульфидных мостиков между двумя полипептидами с цистеиновыми остатками с помощью фермента протеиндисульфидизомеразы (PDI). Этот фермент, как и другие внутриполостные ферменты, обладает высоким сродством к Са, и связывает его в большом количестве.

Функционирование кальциевых сенсоров изучено подробно. Так, кальнексин является интегральным ЭР-белком с молекулярной массой 88 кДа. Его основная функция — связывание неправильно свернутых белков и сохранение их в ЭР для предотвращения их высвобождения в цитозоль. Кальмодулин — наиболее распространенный Са-связывающий белок (14 кДа), обладающий уникальной способностью при соединении с Са2+ значительно изменять конформацию. Образуемый комплекс регулирует активность мембранных насосов, удаляющих свободный ион кальция из цитозоля, участвует в процессах фосфорилирования и активирует Са-кальмодулин-зависимые киназы. Кальретикулин (46 кДа) содержит сигналы задержки синтеза полипептидов и регулирует связывание стероидного рецептора с участием ДНК. Кроме того, он действует как интегринсвязывающий белок и плазматический антикоагулянт. Тропонин представляет собой комплекс из трех полипептидов с молекулярной массой от 18 до 35 кДа. Он связывается с Са2+ и тропомиозином, обеспечивая процесс мышечного сокращения.

Перечисленные выше функции Са свидетельствуют, что в качестве репера целесообразно выбрать только этот элемент. Этот вывод подкрепляется наличием в организме любого живого существа эффективной гормональной системы гомеостаза Са.

Большая часть Са в крови находится в плазме. Коэффициент его распределения между плазмой и цельной кровью достигает 1,84 (Барашков с соавт., 2003а). В плазме Са представлен 3 формами: 1) связанный с белками (около 46%, причем 4/5 в комплексе с альбумином, а 1/5 — с у-глобулином), в комплексе с фосфатом и цитратом (7%), 3) в виде Са2+ (47%). Последняя форма физиологически активна, и ее концентрация поддерживается механизмами гомеостаза.

При недостатке Са2+ стимулируется секреция околощитовидными железами полипептидного паратиреоидного гормона («паратгормон» = «паратирин» = ПТГ). Из витамина D в почках и печени путем последовательного гидроксилирования синтезируется и секретируется кальцитриол (1,25-дигидроксихоле- кальциферол). В результате действия этих двух гормонов концентрация иона металла в крови восстанавливается. Кроме того, кальцитонин подавляет активность остеокластов. Гомеостаз Са2+ должен быть связан с гомеостазом фосфора (Марри с соавт., 1993), хотя в цельной крови такой связи не наблюдается.

Итак, второй ступенью анализа содержания МЭ должно быть выражение результатов многоэлементного анализа в виде соотношения элементов, в первую очередь относительно Са. Эти значения позволяют получить более правильную картину состояния МЛГ, поскольку нивелируют отмеченные выше ошибки определения МЭ. Затем можно рассмотреть соотношения Na/K, Zn/Cu, которые могут подтвердить или опровергнуть наличие определенных патологий. Диапазон значений соотношения элементов в цельной крови жителей центральной России относительно содержания Са (Е/Са) приведен в табл. 2.

Таблица 2. Диапазон соотношений Е/Са в цельной крови (ДИ - доверительный интервал)


Е/Са

Среднее

-95% ДИ

95% ДИ

1

Аl

0,0026

0,002

0,0032

2

Ва

0,0013

0,00065

0,0019

3

Са

1

0,943

1,057

4

Cd

0,00037

0,00031

0,00042

5

Со

0,00025

0,0002

0,0003

6

Сr

0,00081

0,00064

0,00097

7

Сu

0,015

0,014

0,016

8

Fe

7,30

6,66

7,95

9

Ge

0,012

0,01

0,014

10

К

26,03

23,98

28,09

11

Li

0,00009

0,00006

0,00012

12

Mr

0,55

0,51

0,58

13

Мn

0,00036

0,00018

0,00055

14

Мо

0,00035

0,00003

0,00067

15

Na

31,63

30,2

33,0

16

Ni

0,0018

0,00044

0,0032

17

Pb

0,0018

0,0014

0,0021

18

Si

0,021

0,015

0,026

19

Sr

0,0018

0,0013

0,0024

20

Ti

0,00096

0,00014

0,0021

21

V

0,002

0,0018

0,0021

22

W

0,0013

0,001

0,0016

23

Zn

0,096

0,087

0,11

24

P

6,84

6,25

7,42

25

S

26,41

24,59

28,23

Линейные коэффициенты корреляции относительных значений содержания К и Fe в цельной крови оказались аналогичными полученным при сравнении абсолютных цифр (0,95). Это можно объяснить тем, что оба элемента содержатся преимущественно в клетках крови: К — благодаря активности Na-насоса, обеспечивающего электролитный гомеостаз, Fe — благодаря содержанию главным образом в составе гемоглобина в эритроцитах. Отметим, что радиус иона К+ вдвое больше радиуса иона Fe3+(133 и 67 пм).

При статистическом анализе абсолютных результатов высокие линейные коэффициенты корреляции показали пары К-V (0,79), Fe-V (0,75), Na-Mg (0,75), Na-Ca (0,71). Меньшие значения корреляции найдены у пар Аl-Сr (0,64), Zn-Cr (0,63), Al-Ва и Al-Zn (по 0,61). Корреляционные зависимости для остальных элементов менее сильные.

Линейные коэффициенты корреляции относительных результатов дают другую картину. У пар К-V и Fe-V коэффициент корреляции оказывается немного выше (0,81 и 0,77), а у пары Na-Mg — ниже (0,68), чем при сравнении абсолютных значений. В то же время зависимости у остальных пар элементов заметно уменьшаются: у пар Zn-Cr и Al-Zn они снижаются вдвое, а у Аl-Сr, Al-Ва становятся незначимыми. Появляются значимые корреляции у пар К и Fe с Ge (соответственно, 0,68 и 0,62), а также с Cd (0,55 и 0,63). Одновременно обнаруживаются заметные отрицательные корреляции у пар Pb-Ni, Cr-Zn и Na-Mn (соответственно, -0,55; -0,5; -0,4), которые при сравнении абсолютных значений не проявляются.

Таким образом, выражение результатов анализа в относительных единицах обеспечивает по сравнению с абсолютными значениями дополнительную информацию. Полученные данные легко представить в виде гистограмм, наглядно показывающих разницу в содержании элементов при разных патологиях.

Третьей ступенью анализа должна быть детализация механизма патологии у конкретного пациента на базе бионеорганической модели данной патологии. Для этого необходимо знать комплексы ферментов и гормонов с металлами, механизмы их активации, вид и природу мишеней, учитывать их структуру и взаимодействия. Поскольку эти механизмы выяснены далеко не для всех болезней, важной задачей бионеорганики становится углубление знаний о них и о способах их фармакологической коррекции. Несомненно, что при этом не обойтись без гибридных методов анализа, включающих в себя хроматографическую составляющую.

Медицинская бионеорганика. Г.К. Барашков

Похожие статьи
  • 20.07.2012 74441 44
    Типы химических связей

    Каждый атом обладает некоторым числом электронов. Вступая в химические реакции, атомы отдают, приобретают, либо обобществляют электроны, достигая наиболее устойчивой электронной конфигурации. Наиболее устойчивой оказывается конфигурация с наиболее низкой энергией (как в атомах благородных газов&...

    Бионеорганика
  • 21.07.2012 19404 16
    Ионные насосы

    Ионными насосами называют молекулярные механизмы, локализованные в мембране и способные транспортировать вещества за счет энергии, высвобождаемой при расщеплении АТФ, или любого другого вида энергии.

    Бионеорганика
  • 19.06.2012 17249 20
    1 группа (1А подгруппа) — щелочные металлы (главная группа)

    В нее входят Li, Na, К, Rb, Cs, Fr (табл. 1 и 2). По многим химическим свойствам несколько отличается от других щелочных металлов Li+, имеющий диагональное сходство с Mg2+.

    Бионеорганика
показать еще
 
Биотехнологии и биоматериалы