Cтарение в клеточных культурах

Наталья 13 Апреля в 0:00 172 0


Cтарение в клеточных культурах
Использование клеточных культур в геронтологии открывает уникальные возможности для изучения механизмов старения и поиска воздействий, влияющих на этот процесс.

В частности, метод клеточных культур позволяет решать следующие важные задачи.

1. Сравнивая культуры клеток, полученных от доноров разного возраста, можно отличить конститутивные возрастные изменения от индуцированных. Например, установлено, что митотическая активность культур фибробластов человека, находящихся в идентичных условиях, уменьшается с повышением возраста донора клеток (Schneider, Mitsui, 1976; Schneider, 1979).

Следовательно, наблюдаемое в тканях стареющих организмов снижение митотической активности (Gelfant, Smith, 1972; Cameron, Thrasher, 1976) связано с конститутивным изменением самих клеток.

С другой стороны, возрастное увеличение периода индукции тирозинаминотрансферазы печени под действием гидрокортизона (Adelman, 1972) следует считать индуцированным, поскольку в культурах гепатоцитов крыс разного возраста никаких различий в индукции фермента не наблюдается (Britton et al., 1976). Таким образом, применение клеточных культур позволяет установить природу возрастных изменений.

2. Метод клеточных культур открывает уникальные возможности для поиска и тщательного исследования конститутивных биохимических (Виленчик и др., 1979) и цитологических (Schneider, 1979) возрастных изменений. Этот метод позволяет также непосредственно проверять теории старения (Danner et al., 1978).

3. Сравнительное изучение клеточных культур, полученных от разных животных, дает возможность выявить свойства клеток, представляющие особый интерес для биологии старения. Например, установлено, что ПЖ животных положительно коррелирует со способностью фибробластов в культуре репарировать УФ-индуцированные повреждения ДНК (Hart, Setlow, 1974) и отрицательно коррелирует с интенсивностью связывания канцерогенов с ДНК фибробластов этих животных (Schwartz, Moore, 1977, 1979). Следовательно, механизмы защиты генома от повреждений представляют для геронтологии особый интерес.

4. Длительное культивирование (около года) клеток in vitro позволяет моделировать многие изменения, происходящие при старении организмов. И хотя вопрос об адекватности условий in vitro условиям in vivo остается открытым, старению клеточных культур посвящается все большее число экспериментальных, обзорных (Hay, 1967; Бершадский, Гельфанд, 1970; Cristofalo, 1972; Hayfiick, 1977; Гаврилов, Гаврилова, 1978) и теоретических работ (Olovnikov, 1973; Holliday, 1975; Hirsch, 1978; Гаврилов, Ягужинский, 1978).

Критерии и причины гибели клеточных культур

В настоящее время установлена ограниченная продолжительность жизни (ПЖ) следующих клеточных культур: нормальных фибробластоподобных клеток человека (Hayfiick, Moorhead, 1961; Hayfiick, 1965; Harper, Grove, 1979), лошади, нескольких видов кенгуру (Stanley et al., 1975), сумчатого животного Potorous tridactylus (Cristofalo, 1972; Stanley et al., 1975), черепахи (Goldstein, 1974), норки (Hayfiick, 1975), цыпленка (Kaji, Matsuo, 1979) и мыши (Hayflick, 1975, 1977); эпидермальных кератиноцитов (Rheinwald, Green, 1977), клеток глии (Brunk'et al., 1973) и печени человека (Kahn et al., 1977a, 1977b) нормальных хондроцитов (Mayne et al., 1976) и трансформированных вирусом саркомы Рауса фибробластов цыпленка (Ponten, 1970; Leblond-Larouche, Morais, 1976).

Однако при критическом анализе литературных данных (Гаврилов, Гаврилова, 1978) выясняется, что до сих пор нет общепринятых количественных критериев гибели клеточной культуры, а сами понятия — «смерть» и «продолжительность жизни» культуры — чрезвычайно условны и субъективны.

Большинство исследователей называют культуру мертвой, если в течение произвольно заданного интервала времени (обычно от одной до четырех недель) ее численность перестает увеличиваться до желаемой величины, несмотря на благоприятные для роста условия (обычно задается численность, в 2—4 раза превышающая исходную численность культуры).

По этому определению гибель клеток в культуре не обязательна, так как любая культура жизнеспособных, но неделящихся клеток, по данному определению, будет считаться мертвой. Более того, мертвые культуры продолжают медленно расти, хотя они имеют низкую митотическую активность и содержат всего 10—20% клеток, способных к репликативному синтезу ДНК (Cristofalo, Sharf, 1973; Milo, Hart, 1976).

Такие культуры иногда спонтанно восстанавливают нормальные темпы роста и тогда совершают еще несколько удвоений популяции до следующей «смерти» (Holliday, Tarrant, 1972). Массовая гибель клеток в конце жизни культуры, которой придавалось большое значение в ранних работах (Hayfiick, Moorhead, 1961; Hayfiick, 1965), оказалась артефактом, связанным с операцией пересева.

Дело в том, что при культивировании регулярно проводят пересев клеток, т. е. обработку прикрепленного к субстрату клеточного слоя 0.1%-ным раствором трипсина (трипсинизация) и разделение открепившегося пласта клеток до одиночных путем гидродинамического воздействия (суспендирование).



При этом в первую очередь гибнут крупные клетки (Milo, 1973), которых больше всего в старых и мертвых культурах (Bowman et al., 1975; Mitsui, Schneider, 1976). Кроме того, в этих культурах увеличивается число клеточных контактов, которые невозможно разрушить при пересеве, не повреждая самих клеток (Milo, 1973).

Поэтому в условиях медленного роста культуры при постоянном разрушении клеток в процессе пересева создавалось впечатление их полного лизиса. В тех же случаях, когда влияние операции пересева было исключено, никакого увеличения скорости гибели клеток с возрастом культуры не наблюдалось.

Следовательно, ограниченная ПЖ клеточных культур вызвана исключительно снижением митотической активности, а не гибелью самих клеток. Более того, имеются основания предполагать, что именно уменьшение митотической активности является причиной большинства морфологических и биохимических изменений, наблюдаемых в клетках старых и мертвых культур.

Например, оказалось, что описанные в конце жизни культуры «дегенеративные изменения» клеток, которым придавалось большое значение в ранних работах (Hayfiick, Moorhead, 1961; Hayfiick, 1965), являются не причиной, а следствием гибели культуры, т. е. снижения митотической активности. Было обнаружено, что многие так называемые «дегенеративные изменения» можно получить и в молодой культуре, подавив на длительный срок клеточное деление.

Все эти «дегенеративные изменения» бесследно исчезают после нескольких удвоений популяции, если снова создать условия для роста культуры (Brunk et al., 1973). Увеличение размеров клеток при старении культур также, по-видимому, вызвано замедлением и прекращением клеточного деления. Действительно, увеличение размеров наблюдалось только у клеток, уже не синтезирующих ДНК (Bowman et al., 1975).

Приведенные выше факты позволяют утверждать, что проблема старения клеточных культур по существу сводится к изучению причин, механизмов и последствий наблюдаемого снижения митотической активности.

Этот процесс вовсе не обязательно вызван повреждением и старением клеток, а может быть следствием их дифференцировки (Гаврилов, Гаврилова, 1978; Гаврилов, Ягужинский, 1978), которая часто сопровождается уменьшением митотической активности (Truman, 1976). Следовательно, понятия «смерть», «гибель», «старение» и «продолжительность жизни» клеточных культур являются чрезвычайно условными, так же как и понятия «молодые» и «старые» культуры.

Их употребление настраивает исследователей на изучение механизмов нарушений и повреждений, хотя сам факт существования этих повреждений и нарушений в клеточной культуре не доказан, а их роль в снижении митотической активности не установлена.

Поэтому целесообразно использовать другие термины, которые бы акцентировали внимание исследователей именно на том, что происходит на самом деле, т. е. на снижении митотической активности. Такие термины уже введены.

Вместо понятий «продолжительность жизни», «старение», «гибель» и «смерть» клеточной культуры предложено использовать термины «репликативная продолжительность жизни», «репликативное старение», «репликативная гибель» и «репликативная смерть» культуры клеток.

Понятия «молодые» и «старые» культуры также сейчас используются с прилагательным «репликативный». Молодые (делящиеся) клетки названы репликативными, а старые и мертвые (неделящиеся) — пострепликативными.

Для краткости иногда пользуются старыми понятиями, помещенными в кавычки, подчеркивая таким образом их условность (Norwood et al., 1974; Гаврилов, Гаврилова, 1978). Показательно, что сейчас даже биологический возраст культуры определяют по процентному содержанию клеток, не способных к репликативному синтезу ДНК (Cristofalo, Sharf, 1973; Bowman et al., 1975).

В настоящее бремя установлены следующие основные проявления «старения» клеточных культур.

1. Уменьшается доля клеток, способных делиться (Merz, Ross, 1969; Cristofalo, Sharf, 1973).

2. Увеличивается период митотического цикла. Радиоавтографическим методом обнаружено увеличение минимального периода генерации клеток в культуре фибробластов человека с 16 до 21—22 ч (Macieira-Coelho et al., 1966). Кинематографическое исследование выявило увеличение среднего времени между делениями при «старении» культуры фибробластов человека с 16.8 до 32 ч (Absher et al., 1974).

3. При «старении» клеточных культур усиливается тормозящее влияние плотности популяции на скорость роста (Macieira-Coelho et al., 1966; Absher et al., 1974; Schneider, Mitsui, 1976), поэтому плотность насыщения у репликативно старых культур оказывается примерно в 2 раза меньшей, чем у «молодых» культур (Schneider, Mitsui, 1976).

Н.И. Аринчин, И.А. Аршавский, Г.Д. Бердышев, Н.С. Верхратский, В.М. Дильман, А.И. Зотин, Н.Б. Маньковский, В.Н. Никитин, Б.В. Пугач, В.В. Фролькис, Д.Ф. Чеботарев, Н.М. Эмануэль
Похожие статьи
показать еще
Prev Next